细胞热迁移分析技术及其在靶标发现中的应用进展

徐雨昕，季静静，张巧艳，秦路平，张泉龙

(浙江中医药大学药学院中药资源教研室，杭州 311402)

生物活性小分子的蛋白质靶点鉴定和分子作用机制的阐明是药理学与毒理学研究的重要内容之一。明确化合物的作用靶点是药物研发的关键步骤，有助于阐明其作用机制，发现可能的毒性机制，并有针对性地进行结构优化和改造。随着基因组学、转录组学、蛋白质组学等技术的发展，新的药物靶标发现技术不断涌现，各有优势。如以化合物为中心的化学蛋白质组学(compound-centric chemical proteomics,CCCP)、基于活性的蛋白质分析(activity-based protein profiling,ABPP)[1]等方法，但这些方法需要对化合物进行标记，易导致化合物活性减弱或阻碍化合物与靶点的结合。近年来，基于蛋白质稳定性变化的生物物理学方法开发了无需对小分子化合物进行改造的靶标筛选技术，如基于蛋白酶解稳定性开发的依赖于靶点稳定性的药物亲和反应(drug affinity responsive target stability，DARTS)技术，以及根据蛋白质氧化稳定性开发的基于氧化速率的蛋白质稳定性测试(stability of proteins from rates of oxidation，SPROX)技术，用于化合物蛋白质靶标的发现，但由于技术限制，这些技术尚未得到广泛使用。

细胞热迁移分析(cellular thermal shift assay，CETSA)技术是近年来开发的一种新型药物靶标发现技术，其原理是当靶蛋白与药物分子结合时，靶蛋白通常会变得稳定，不容易被热变性[2]。CETSA技术无需任何蛋白质或小分子标记，可用于研究小分子对全细胞裂解物、细胞及组织中蛋白质的热稳定性影响。早期CETSA技术用于鉴定预知可能的靶蛋白，并且一次只能检测少量蛋白质，但随着CETSA技术与高分辨质谱技术的结合，可以在没有任何预知的情况下识别多个靶蛋白，并且允许研究者在短时间内研究扰动对数千种单个蛋白质的影响。本文重点讨论CETSA技术的原理、方法及其在药物靶标发现中的应用进展。

1 CETSA技术的原理及方法演变

瑞典Karolinska研究所团队依据蛋白质和药物结合时热稳定性有所提高的特征，首次开发了一种称为CETSA的实验方法[2]，可以直接在细胞或组织内检测药物和靶标蛋白的结合亲和力，为直接在细胞或组织内检测药物和靶标蛋白的相互作用、跟踪药物的迁移、脱靶效应以及耐药性开辟了一条新途径。该方法主要包括以下步骤：(1)样品准备；(2)药物干预；(3)热反应；(4)蛋白质提取；(5)蛋白质鉴定;(6)数据处理。见图1。

图1 细胞热迁移分析(CETSA)的操作流程图

1.1 样品准备 细胞裂解液、完整细胞或组织样品均可用于CETSA实验。采用细胞裂解液处理可用于发现药物直接作用的靶标蛋白；采用完整细胞处理可同时发现药物作用细胞的直接靶点及其下游效应蛋白。细胞裂解液实验是细胞先裂解，后热处理；完整细胞实验是先热处理，后裂解。如抗菌药TH1579能够稳定MTH1蛋白。然而，在完整细胞，TH1579还能够稳定脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase，dCK)，一种从降解DNA中回收脱氧核苷的酶。其原因为MTH1抑制剂能够促进DNA损伤，导致脱氧核苷蓄积，引起dCK热稳定[3]。

1.2 药物干预和热处理 药物干预可以采用单一浓度或梯度浓度。单一浓度的药物干预后，采用一系列梯度温度进行热迁移，称为热迁移分析实验，能够检测出一个化合物的主要靶标。如采用该方法能够发现十字孢碱抑制的49个激酶(已知66个)[4]，经过热迁移分析，这些激酶的热迁移值(Tm,即某种蛋白质绝对量减少一半时的温度)迁移度均>1 ℃。但Tm的大小并不能代表配体与激酶的亲和力，因为Tm的改变一方面受配体与激酶的亲和力影响，另一方面还由激酶自身的热稳定性决定。

为评价配体与激酶的亲和力，可采用等温剂量反应(isothermal dose-response,ITDR)分析。该方法采用一系列梯度浓度药物干预细胞，并加热到一个恒定的温度进行。K562细胞提取物与一系列浓度的GSK3182571反应，加热至53 ℃进行等温剂量反应实验，其测得的亲和度与Kinobeads竞争性结合实验结果之间表现出良好的一致性[4]。

二维蛋白质组热稳定性分析(two-dimensional thermal proteome profiling,2D-TPP)是近年来新出现的技术[5]。该方法中细胞与一系列浓度的化合物反应，同时采用不同温度进行热处理，从而使靶标识别的分辨率更加灵敏，化合物与靶标的亲和力测定更加快捷。2D-TPP可以使药物干预组与未干预组在同一质谱条件下进行定量，得到更加精确的量化指标，同时增加了在不同浓度下蛋白质的稳定性考察，增加了对数据的质控，过滤了假阳性结果。Becher等[5]首次采用2D-TPP发现了panobinostat的脱靶(off-target)苯丙氨酸羟化酶。

1.3 可溶性蛋白质的提取 根据CETSA的原理，药物与靶标蛋白质结合后使蛋白质变得稳定，经过热处理后，孵育体系中蛋白质与配体(如药物分子)结合后仍保持折叠状态，变得相对稳定,而没有结合配体的蛋白质会解折叠，从而迅速变性、聚集产生沉淀。这些不稳定的蛋白质经低温超速离心(相对离心力1.0×104×g～1.0×105×g)可以去除。该过程中裂解液的选择尤为关键，裂解液的作用是为了提取细胞中更多的蛋白质，同时使蛋白质在整个处理过程中变得稳定。常用的裂解液包括加有混合蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)裂解液，非变性裂解液[pH 7.5，含0.05 mol/L N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)，0.005 mol/L β-甘油磷酸钠,0.000 1 mol/L Na3VO4,0.01 mol/L MgCl2,0.002 mol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP),蛋白酶抑制剂]。在最初的操作规程中，膜蛋白因其不溶性而未能得到分析。为获取膜蛋白，可在裂解液中添加0.4%NP-40。NP-40是一种能溶解膜蛋白的洗涤剂，不影响细胞质中蛋白质成分的溶解性。同时添加0.4% NP-40不改变细胞中蛋白质的Tm[6]。Reinhard等[6]在CETSA实验中将含0.4% NP-40的PBS作为裂解液，发现过钒酸钠作用于膜蛋白CD45及其下游通路。Hashimoto等[7]采用CETSA技术筛选膜蛋白-人溶质载体家族16成员1(SLC16A1)的抑制剂，0.5%十二烷基-β-D-麦芽糖苷也被用于膜蛋白裂解液，其对SLC16A1的稳定性优于NP-40裂解液。

1.4 蛋白质鉴定 早期CETSA技术更多通过免疫印迹(Western blot)实验应用于靶标验证工作,因此必须依赖合适的目标靶蛋白抗体,无法预测未知靶蛋白。随着平行多通道定量蛋白质组学技术(iTRAQ/TMT)的发展,来自欧洲分子生物学实验室的Savitski研究组将CETSA技术与高分辨质谱技术相结合，推出一种全新的基于蛋白质热稳定性的高通量靶标筛选方法——蛋白质组热稳定性分析(thermal proteome profiling,TPP)技术，又名MS-CETSA[4]。该技术具有无偏见性、灵敏度高等优点。TPP技术通过对经热处理后获得的可溶蛋白质进行酶解，并对肽段进行稳定同位素标记，将不同温度处理的样品混合后进行离线肽段分级,最后利用定量质谱分析肽段的相对含量并得到每个蛋白质在小分子处理组和对照组的热熔曲线，通过拟合热熔曲线计算蛋白质的Tm。TPP法主要为获取不同温度、不同浓度或不同细胞状态条件下蛋白质的变化趋势，计算蛋白质热熔曲线、Tm值、pEC50值(半数最大有效浓度的对数值)等，亦有通过计算热迁移面积f(T)评价蛋白质热迁移的报道[8]。常用的数据处理R软件包包括：mineCETSA[8]、TPP[9]、mstherm (https://CRAN.R-project.org/package=mstherm)。

此外，Park 研究组开发了一种基于二维荧光凝胶差异的热稳定性分析技术(thermal stability shift-based fluorescence difference in two-dimensional gel electrophoresis,TS-FITGE)[10]。该方法在热处理并高速离心获得可溶性蛋白质后，将不同荧光标记试剂分别加入对照组(Cy3,绿色)和实验组(Cy5,红色)。将相同处理温度的实验组和对照组物质混合并进行二维电泳,再经图像自动处理可以得到混合点的两种荧光标记的比值并定量。与采用TMT标记的TPP方法相比,TS-FITGE 技术的最大优势在于无需使用成本较高的稳定同位素标记试剂，在发现目标候选物上存在互补性，但从操作方法和数据分析上，TPP法更为简便、灵敏，可直接完成目标蛋白质的定量定性分析。CETSA及TPP的应用情况见表1[2,4-6,8,11-20]。

2 CETSA技术在药理学与毒理学中的应用

2.1 药物靶标的确证及药物亲和力分析 CETSA技术的优点在于可以从细胞裂解液、活细胞或组织中验证药物与靶蛋白的相互作用。通过药物浓度的递增或热反应温度的梯度递增，结合Western blot技术检测靶蛋白的热熔曲线及等温剂量反应曲线评价药物与靶蛋白的结合力。近年来，将CETSA技术与高内涵影像(high content imaging)[21]、高内涵免疫荧光检测(high content immunofluorescent，HCIF)[22]、 分裂纳米荧光素酶法(split nano luciferase approach，SplitLuc)[23]、 Nanoluc检测法[24]等方法相结合，开发出一系列高通量药物靶点筛选方法，已成功用于p38α抑制剂[25]、B-Raf和聚(ADP-核糖)聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1)蛋白抑制剂[26]、雄激素受体药物亲和力[27]、细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase,CDK2)抑制剂[23]的筛选研究。

表1 CETSA及TPP的应用情况汇总

2.2 药物脱靶的发现 药物脱靶效应即药物设计之外的额外靶点，是导致药物副作用的主要原因。Savitski等[4]采用TPP法发现了几个蛋白酶抑制剂(如丝氨酸酶抑制剂维罗非尼，间变性淋巴瘤激酶抑制剂阿来替尼)中与毒性相关的脱靶——亚铁螯合酶(ferrochelatase)。亚铁螯合酶是血红素生物合成中的末端酶，已知该酶的失活变性会导致红细胞生成性原卟啉症，从而导致肝损伤和严重的光敏反应。这也是维罗非尼产生光敏性副作用的原因。

2016年，Becher等[5]采用2D-TPP法研究抗癌药物组胺去乙酰化抑制剂帕比司他(panobinostat)，除了已知靶点外，还发现了一些未知靶点，如苯丙氨酸羟化酶[5]。细胞实验也证实帕比司他能增加细胞内苯丙氨酸的浓度，减少酪氨酸生成，这与其有效抑制苯丙氨酸羟化酶相关。这些发现为解释临床患者使用帕比司他后出现甲状腺激素水平降低的不良反应提供了理论依据。

2.3 病原菌药物靶点的确证 TPP可用于研究细菌细胞中大多数蛋白质的活性和结构，以及药物对细菌的影响。Mateus等[15]将MS-CETSA(又名TPP)法成功用于考察大肠杆菌(Escbericbiacoli)的生长周期变化及抗菌药物的分子作用机制，在细胞裂解液及活细胞内发现了氨苄西林的作用靶点青霉素结合蛋白家族成员(MrcA、DacB等)，并且发现氨苄西林耐受的β-内酰胺酶AmpC也是氨苄西林的作用靶点。

Dziekan等[17]利用MS-CETSA法对人疟疾的主要致病原恶性疟原虫进行了药物靶向鉴定，发现恶性疟原虫嘌呤核苷磷酸化酶(Plasmodiumfalciparumpurine nucleoside phosphorylase，PfPNP)是抗疟药物奎宁和甲氟喹的共同结合靶点。

2.4 细胞内物质与蛋白质相互作用的发现 三磷酸核苷酸(nucleosides triphosphate，NTPs)在细胞的生化过程中起着非常重要的作用，三磷酸腺苷(adenosine triphophate，ATP)是细胞中最丰富的NTPs。Sridharan等[28]利用CETSA法与多重定量质谱相结合，通过设置一系列ATP浓度及温度处理细胞，在蛋白质层面上得到ATP相关二维热蛋白质图谱，从而揭示蛋白质组中ATP浓度依赖性的蛋白质稳定性。

蛋白质之间的相互作用在不同的细胞状态和条件下是不断变化的，由蛋白质相互作用形成的蛋白质复合物在细胞中发挥着重要的作用。Tan等[29]利用多维TPP法分析细胞中的蛋白质复合物发生的动态变化。其利用多维TPP法确定上千种蛋白质的热熔曲线，然后基于这些热熔曲线之间的相似性，采用热邻近共聚合(thermal proximity coaggregation，TPCA)技术高通量监测细胞内蛋白质复合物动力学。这种方法在很多已知的蛋白质复合物中得到验证，可用来高通量地监控细胞内的蛋白质复合物动态变化。这些研究人员利用TPCA法鉴定出很多没有差异性蛋白质表达的蛋白质复合物，如在细胞周期的S期受到调节的染色质结合蛋白质复合物。他们还利用这种方法鉴定出6种细胞系中的细胞特异性的蛋白质相互作用，凸显了此方法鉴定受到疾病影响的蛋白质复合物的潜力。

3 小结和展望

目前，CETSA技术与高分辨质谱技术相结合，已经成功应用于大肠杆菌、人类细胞、植物等多种生物体的研究，药物靶标的发现及细胞内代谢物与蛋白质相互作用的研究。最新研究已将TPP法成功用于在体组织药物靶标确证[30]。此外，TPP技术还用于植物温度胁迫响应对蛋白质热稳定性的影响，为解析植物热响应开辟了新渠道[31]。广义来说， MS-CETSA技术为从细胞蛋白质组学水平研究外界及内部因素对细胞或组织的扰动提供了新的机会,但还面临以下挑战：(1)蛋白质覆盖率。目前CETSA技术适用于细胞中可溶性蛋白质的相互作用研究，但不适用于细胞膜上的水不溶性蛋白质。尽管加入NP-40或十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)能够提高膜蛋白质的溶解度，但其对蛋白质的活性及药物响应性的影响有待进一步研究。因此，采用合适的裂解液或者载体来提高细胞蛋白质与药物的反应率及检出率是亟待解决的问题之一。(2)热邻近共聚合的影响。细胞中存在多种蛋白质复合物，其由多个亚基组成，这些亚基具有热邻近共聚合现象。一个蛋白质复合物中有一个最不耐热的亚基，当配体与该亚基结合后变得热稳定，从而导致其他与之聚合的亚基也变得热稳定，产生热迁移，增加了假阳性的发生率。目前采用多维度MS-CETSA方法，有助于发现热邻近共聚合现象，提高蛋白质靶标检测的灵敏度和靶标准确性。综上所述，CETSA技术与多种检测分析技术相结合，有助于高通量鉴定药物的靶标蛋白，以及实现化合物靶标及脱靶效应研究的无偏见性。