直肠癌患者伊立替康化疗敏感性与拓扑异构酶1水平的关系

徐 佳，蔡东焱，刘晓媛，顾 盼，陈 杨，周少丹*

(1.江南大学附属医院药学部，江苏无锡 214121；2.江南大学附属医院肿瘤内科，江苏无锡 214121)

目前，外科手术是治疗直肠癌的常用方式，以手术为主的治疗方式5年生存率可达50%～80%，然而部分患者术后可能发生复发、远处转移等不良事件[1]。对于晚期直肠癌患者，临床通常建议通过化疗改善病情，延长生存期，但因存在个体差异，不同病例对化疗药物的敏感性也有差异[2]。含伊立替康的FOLFIRI方案是目前结直肠癌主要的化疗方案之一，可将晚期结直肠癌患者的生存时间延长至30个月[3]。拓扑异构酶1(topoisomerase 1,TOPO-1)对维持生物体运行有重要作用，可调节DNA修复、转录、复制等过程。研究指出，TOPO-1可引起恶性肿瘤DNA长链断裂和再修复，引发DNA出现不可逆损伤，最终引发肿瘤细胞死亡[4]。伊立替康属于喜树碱半合成衍生物，对TOPO-1有抑制作用，从而将DNA单链断裂后阻断修复途径[5]。本研究旨在观察直肠癌患者伊立替康化疗敏感性与TOPO-1水平的关系，报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 纳入江南大学附属医院2017年1月-2019年6月收治的直肠癌患者80例，所有患者均接受以伊立替康为主的化疗方案。其中男性43例，女性37例，年龄42～79岁，平均年龄(65.39±9.64)岁；临床分期：Ⅲ期48例，Ⅳ期32例；分化程度：低分化41例，中/高分化39例；肿瘤类型：原发性51例，转移性29例；病理类型：管状腺癌30例，乳头状腺癌27例，黏液腺癌12例，印戒细胞癌11例。

1.2 纳入标准和排除标准

1.2.1 纳入标准 (1)化疗前行内镜下活检，病理诊断为直肠癌；(2)接受以伊立替康为主的化疗方案；(3)入院前未接受过其他化疗、放疗；(4)至少有1个可测量病灶；(5)具有签署知情同意书的能力。

1.2.2 排除标准 (1)患有其他原发性肿瘤；(2)预计生存期不超过3个月；(3)对本次化疗方案不耐受；(4)未采集到合格的病理组织用于检测。

1.3 TOPO-1水平的检测 所有纳入患者于入院后第2天，经免疫组化法测定TOPO-1在病灶组织中的表达水平。(1)蜡切片方法：①行肠镜活检，取病理组织，经福尔马林固定液(浓度为10%)固定，促进细胞和组织中蛋白质变性、凝固。②针对组织块行脱水处理，脱去残余水分，置于二甲苯内脱乙醇。③取组织块浸泡于石蜡内，然后存放于融蜡箱中，经包埋处理后，取石蜡液置于器皿内，冷却，凝固。④取包埋组织，置于切片机，切成厚度约5 μm的薄片，然后将切片置于摊片机烫平，使薄片尽量贴于载玻片，在45 ℃恒温箱中进行干燥。⑤将干燥的切片依次置入从高至低浓度的酒精，最后放入蒸馏水，将石蜡成分脱去，清洗组织切片，行染色处理。(2)免疫组化法：①取石蜡切片，在温度为70 ℃的烤箱烤2 h，脱蜡。②用酒精脱吐温，经自来水清洗5 min。③行修复抗原，时间为3 min，用浓度为3%的H2O2去离子水进行孵育，时间为10 min，经磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次2 min。④滴入TBST冲洗液，各玻片加入30 μl。⑤用PBS冲洗3次，每次2 min，加入1滴一抗，振荡玻片，将组织抗原与加入液体充分混合，在37 ℃恒温箱中反应4 h。⑥各玻片取TBST冲洗液30 μl进行冲洗，加入二抗，振荡，在37 ℃恒温箱中反应20 min。⑦用TBST冲洗液清洗两次，每次2 min，用TBST冲洗液浸泡3次，每次2 min。⑧行DAB显色，时间为3 min。行苏木素复染，分解染色，烘干，封片。在显微镜下进行观察，取5～10个高倍视野，计算阳性染色肿瘤细胞的占比。

1.4 血样采集和测定 观察患者化疗8个周期后的近期疗效，将治疗无效者视为伊立替康化疗不敏感，将治疗有效者视为伊立替康化疗敏感，分为敏感组和不敏感组，比较两组患者的TOPO-1水平。分别在患者入院时、化疗8个周期后，空腹状态下采集2 ml静脉血，2000 r/min离心10 min，分离血清，经化学发光免疫法测定血清糖类抗原19-9(CA19-9)、癌胚抗原(CEA)水平，比较两组患者的血清指标。

1.5 化疗方案 患者均接受以伊立替康为主的化疗方案。其中有48例行伊立替康+氟尿嘧啶+亚叶酸钙化疗方案，180 mg/m2伊立替康(100 mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司)，静脉滴注，第1天；400 mg/m2亚叶酸钙[10 ml∶0.1 g(以亚叶酸计)，江苏恒瑞医药股份有限公司]，静脉滴注，第1天；400 mg/m2氟尿嘧啶，静脉推注，第1天；2400 mg/m2氟尿嘧啶(10 ml∶0.25 g，天津金耀药业有限公司)，持续静脉滴注46～48 h，每隔2周重复1次，干预8个周期后评价疗效。有32例患者行伊立替康+卡培他滨方案化疗，200 mg/m2伊立替康，静脉滴注，第1天；1000 mg/m2卡培他滨(0.5 g/片，上海罗氏制药有限公司)，口服，bid，第1～14天；每隔3周重复1次。

1.6 疗效评价[6]完全缓解：病灶完全消除；部分缓解：病灶缩小幅度≥30%；稳定：病灶缩小幅度<30%或增加幅度<20%；进展：病灶增加幅度≥20%或有新病灶生成。将干预后完全缓解或部分缓解患者纳入敏感组，稳定或进展患者纳入不敏感组。

2 结 果

2.1 两组患者TOPO-1表达水平的比较 在80例患者中，有32例(40.00%)部分缓解，26例(32.50%)稳定，22例(27.50%)进展。将部分缓解患者纳入敏感组(n=32)，将稳定和进展患者纳入不敏感组(n=48)。敏感组患者的TOPO-1表达水平为(16.39±3.26)%，显著高于不敏感组的(11.28±2.11)%(P<0.001)。

2.2 TOPO-1表达对伊立替康化疗敏感性的评估价值分析 TOPO-1表达评估伊立替康化疗敏感性的曲线下面积(AUC)为0.780(标准误=0.054，P<0.001，95%CI:0.675～0.886)，最佳界值为14.34%，敏感度为71.40%，特异度为80.00%。ROC曲线见图1。

图1 TOPO-1表达评估伊立替康化疗敏感性的ROC曲线

2.3 两组患者CA19-9和CEA血清水平的比较 两组患者治疗前的CA19-9和CEA的血清水平比较无显著性差异(P>0.05)，敏感组患者治疗后的CA19-9和CEA的血清水平显著低于治疗前，与不敏感组治疗后也有显著性差异(P<0.05)，见表1。

表1 两组患者CA19-9和CEA血清水平的比较

2.4 TOPO-1表达水平与CA19-9、CEA血清水平的相关性 Pearson线性相关检验发现，TOPO-1水平与CA19-9、CEA血清水平呈正相关(r=0.817，P<0.001;r=0.701，P<0.001)。线性相关图见图2。

3 讨 论

直肠癌是比较常见的消化道肿瘤，早期直肠癌患者经手术治疗可获得较理想治疗效果，但部分患者就诊时，病情已进入晚期，错过最佳手术时机。直肠癌根治术后复发患者5年生存率为10%～68%[7]。研究显示，伊立替康用于晚期结肠癌效果显著，优于FOLFIRI治疗方案[8]。与氟尿嘧啶相比，伊立替康对结直肠癌的疗效更好，可提升总缓解率[9]。本研究表明，80例患者经含伊立替康的化疗方案治疗后，有32例患者对该药敏感，总缓解率为32.50%，

但仍有48例患者对该药敏感性欠佳。 因此，临床需明确影响直肠癌患者伊立替康化疗敏感性的机制，为治疗提供依据。

图2 TOPO-1表达水平与CA19-9、CEA血清水平的线性相关图

TOPO-1被证实参与了DNA拓扑结构的调节过程，且其在多种生物体中均存在，如原核细胞、真核细胞等[10]。研究发现，在DNA复制过程中，双螺旋打开，并形成单链，各单链互不交叉，在单链折叠、双螺旋化过程中，TOPO-1发挥着重要作用，这表明TOPO-1可能是恶性肿瘤治疗的一个作用靶点。另有研究提示，在乳腺癌、肺癌等肿瘤组织中，TOPO-1的含量均较高，且这类患者往往对TOPO-1抑制剂有更高敏感性[11-12]。本研究中，伊立替康敏感者的TOPO-1表达水平高于不敏感者，与上述文献报道结果相符。伊立替康作为一种TOPO-1抑制剂，对TOPO-1表达具备良好的抑制作用[13]。该药进入组织后，可通过羧酸酯酶作用，促进生成有活性的SN-38，形成中间产物，其抗肿瘤活性更强[14]。有研究发现，转移性直肠癌患者的肿瘤组织中TOPO-1表达含量普遍较高，且TOPO-1高表达者对伊立替康的敏感性更好，主要原因在于高表达者的肿瘤细胞对该药更敏感。因此，对于TOPO-1高表达者，伊立替康能够使TOPO-1进一步被抑制[15]。本研究发现，患者经含伊立替康的化疗方案治疗后，不敏感者的CA19-9和CEA血清水平无明显变化，而敏感者的CA19-9和CEA血清水平显著下调，提示对伊立替康敏感的患者疗效良好。经Pearson线性相关检验，发现TOPO-1水平与CA19-9、CEA血清水平有较强相关性。这表明肿瘤组织中TOPO-1水平越高，其CA19-9和CEA的血清水平也越高，间接提示直肠癌病灶组织中TOPO-1的表达情况能作为预测其疗效的重要依据。

综上，直肠癌患者采用含伊立替康的方案化疗，敏感者的肿瘤组织中TOPO-1表达水平显著高于不敏感者，且其表达水平与CA19-9、CEA的血清水平呈正相关，临床医师可将直肠癌组织中TOPO-1表达情况作为评价伊立替康疗效的指标。然而，本研究也有局限性，如样本量较小，未进行远期随访，未来将增加样本量，并观察该化疗方案在直肠癌患者中的远期疗效。