红外频谱照射及超低频电磁场处理水对糖尿病大鼠肾损伤的干预作用

冯婧 刘雨梦 刘嘉鹏 张晓凤 傅亮 车宇娥 王谦 李姝玉 王欣

1.北京中医药大学中医学院，北京 102401；2.广东骏丰频谱股份有限公司，广东 广州 510623

糖尿病是由于绝对或相对的胰岛素生物活性降低或效应不足而导致的疾病，临床上常表现为“三多一少”的症状，即多饮、多食、多尿及体重减轻。单次剂量腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病模型是实验研究中常用的大鼠模型之一，具有简便、易操作的特点。超低频电磁场处理水（简称频谱水）是将普通饮用水经过超低频电磁场处理后，使其物理化学特性发生改变的一种特殊处理水，安全无毒且能改善机体微循环，提高机体免疫功能，并在提高抗氧化能力等方面有一定作用［1］。红外频谱照射具有改善局部微循环、抗感染，提高机体抗损伤、抗病能力以及促进组织修复等功能，可提高动物体内抗氧化酶的活力，减少氧化应激产物，提高抗氧化能力。本实验采用STZ 腹腔注射致大鼠糖尿病模型，通过对血糖、尿酸、肌酐等生化指标肾脏病理学改变进行观察，探讨红外频谱照射及频谱水对STZ 所致大鼠糖尿病模型的治疗作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8 周龄健康雄性SD 大鼠90 只，体重（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004，饲养于北京中医药大学实验动物中心，恒温（22～24℃），湿度45%～55%，自由觅食饮水，每日更换垫料。

1.2 实验药品与试剂 STZ、PBS 缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、HE 染色液、4%多聚甲醛、2.5%戊二醛等购于北京索莱宝科技有限公司；盐酸二甲双胍片（格华止）购于中美上海施贵宝制药有限公司；血清尿素氮、肌酐、尿酸检测试剂盒购于南京建成生物科技有限公司；尿微量白蛋白ELISA 试剂盒购于江苏科特生物技术有限公司；快速血糖检测仪及血糖试纸购自美国Roche。

1.3 实验仪器 骏丰频谱治疗保健仪和频谱水治疗仪由广东骏丰频谱股份有限公司提供。低温高速离心机（德国，Eppendorf），全波段酶标仪（德国，Bio-tek），超低温冰箱（日本，SANYO），全自动脱水机（德国，Leica），全自动包埋机（德国，Leica），全自动石蜡切片机（德国，Leica），全自动染色机（德国，Leica），全自动封片机（德国，Leica），荧光倒置显微镜（日本，Olympus），单道可调移液器（德国，Eppendorf）等。

1.4 动物分组与模型建立 90 只健康雄性SD 大鼠大鼠适应性喂养1 周后按体质量随机分成正常对照组18 只，糖尿病模型组72 只。模型组动物禁食（不禁水）12h，一次性腹腔注射2% STZ 溶液50mg/kg（现用现配，取适量STZ，用0.1mol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在冰浴中配制，pH＝4.4），正常对照组腹腔注射等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，3 天后鼠尾静脉取血，测随机血糖，以随机血糖≥16.7mmol/L 为造模成功，随后按大鼠体质量随机分为模型组和各处理组，每组18 只，处理组包括外照组、频谱水组、盐酸二甲双胍组（阳性药对照组）。动物模型建立后，各组动物进行8 周如下处理：灌胃剂量0.5mL/100g 体质量，正常组、模型组每日灌胃生理盐水一次，盐酸二甲双胍组每日灌胃二甲双胍一次（0.15g/kg），外照组大鼠进行每日红外照射一次（照射条件为2 档，30min，以下简称外照组），以上四组动物均可自由饮用普通水；频谱水组大鼠每日自由饮用超低频电磁场处理水（以下简称频谱水组）。

1.5 方法及观察指标

1.5.1 大鼠一般状态观察。观察大鼠的精神状态，包括体质量、饮食、皮毛及活动情况等，每2 周称量体质量、检测空腹血糖一次并记录。每4 周留取24h 代谢尿。空腹血糖取大鼠尾部血检测，将大鼠尾部尖端用酒精棉签消毒后，采血针扎破皮肤，用干净棉签擦去第1 滴血，用血糖试纸、血糖仪采集第2 滴血，读取血糖值。

1.5.2 血清检测尿素氮、肌酐、尿酸水平。第8 周末，每组取8 只大鼠，大鼠禁食不禁水12h，检测空腹血糖数值后，用10%的水合氯醛，按照3mL/kg 剂量腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血5mL，将血液垂直静置2h 后，放置于4℃的离心机中，3000r/min，离心15min，取上层血清分装于冻存管中，-80℃保存。使用血清尿素氮、肌酐、尿酸检测试剂盒，严格按照试剂盒说明，分别检测上述指标血清含量水平。

1.5.3 Elisa 法检测24h 尿微量白蛋白水平。分别于第4 周末、第8 周末取8 只大鼠24h 代谢尿，使用大鼠尿微量白蛋白Elisa 检测试剂盒，严格按照要求分别检测上述指标血清含量水平。

1.5.4 肾组织病理学观察。第8 周末，各组动物麻醉后，无菌摘取肾脏。取适量肾组织经10%甲醛固定、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，制成3μm 的石蜡切片，进行HE 染色并进行光镜观察。取小于1mm3的肾组织，2.5%的戊二醛固定1～2h 后，至4℃环境，用0.1M PBS 洗 2 次，1%的锇酸固定 1～2h，0.1M PBS 洗 2次后，依次用50%、70%、90%乙醇脱水各1 次，每次5～10min。随后室温下100%乙醇脱水3 次，用100%乙醇∶环氧丙烷＝1∶1 室温浸泡10min，环氧丙烷室温浸泡10min，Epon812∶环氧丙烷＝1∶1 浸透，真空干燥仪（0.2～0.4kg/cm2）2h 以上，Epon812 包埋。组织经过 40℃ 2h、60℃ 4h、80℃ 10h 聚合，超薄切片，分别用铀、铅染色各15min 和10min，透射电镜下观察。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0 进行数据分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状态观察 饲养8 周后，正常对照组的大鼠饮食、大小便、活动等无明显变化，皮毛色泽正常，体质量明显增加。与正常组大鼠相比，各模型组在造模等1 周均出现活动迟缓、精神不振、尿量增多、饮水量明显增多、皮毛缺乏光泽、黄褐色毛发等症状。模型组大鼠饲养过程中，各时间点的体质量与正常组相比，均明显减轻（P<0.05）。与模型组相比，各时间段外照组、频谱水组、盐酸二甲双胍组（阳性药组）的大鼠以上情况得到不同程度的回升，其中盐酸二甲双胍组在第4周、第6 周及第8 周体重与模型组相比明显升高（P<0.05）。见表 1。

2.2 血糖试纸法测定空腹血糖 模型组大鼠的空腹血糖在 2、4、6、8 周末均明显高于正常对照组（P<0.05）。盐酸二甲双胍组在4、6、8 周末低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），但仍高于正常对照组。外照组、濒谱水组大鼠第6 周、第8 周的血糖水平较模型组有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），但仍高于正常组。见表2。

表1 不同时间点各组大鼠体质量变化（g，）

表1 不同时间点各组大鼠体质量变化（g，）

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

组别 n 0 周 2 周末 4 周末 6 周末 8 周末正常对照组 18 269.00±12.96 356.62±29.13 377.87±31.65 483.25±36.12 543.87±41.50模型组 18 264.00±18.71 298.59±27.33* 305.44±49.73* 386.87±70.82* 415.00±87.2*外照组 18 259.72±13.99 296.56±21.02* 307.13±39.41* 394.07±57.29* 445.33±78.17频谱水组 18 266.94±18.21 291.16±27.13* 308.27±47.04* 384.41±76.47* 420.28±76.38盐酸二甲双胍组 18 262.81±12.64 307.13±25.12* 343.57±28.87△ 436.79±46.76△ 483.07±73.19△

表2 各组大鼠不同时间点空腹血糖变化（mmol/L，）

表2 各组大鼠不同时间点空腹血糖变化（mmol/L，）

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

组别 n 2 周末 4 周末 6 周末 8 周末正常对照组 18 5.80±0.919 5.86±1.338 5.30±0.298 6.15±0.602模型组 18 19.09±5.608* 19.62±3.944* 21.31±5.185* 24.73±3.142*外照组 18 19.45±4.405* 17.52±5.605* 19.65±5.104* 21.40±7.674*频谱水组 18 20.08±6.074* 20.65±5.181* 19.73±6.963* 20.47±7.674*盐酸二甲双胍组 18 18.48±2.396* 13.06±6.113*△ 13.46±5.589*△ 16.52±5.694*△

2.3 血清学检测肾功能指标水平 血清检测显示，模型组尿酸、尿素氮、肌酐水平均高于正常对照组（P<0.05）；外照组、频谱水组、盐酸二甲双胍组的血清尿酸较模型组下降（P<0.05）；盐酸二甲双胍组的尿素氮低于模型组（P<0.05）；外照组、频谱水组、盐酸二甲双胍组的肌酐含量低于模型组，差异有统计学意义。见表3。

表3 各组大鼠血清尿酸、尿素、肌酐变化（）

表3 各组大鼠血清尿酸、尿素、肌酐变化（）

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

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2.4 血清学检测24h 尿微量白蛋白水平 大鼠尿微量白蛋白结果显示，4 周末，模型组大鼠尿微量白蛋白明显高于模型组（P<0.05），而盐酸二甲双胍组较模型组水平下降（P<0.05）；8 周末，模型组与正常组相比无差异（P＞0.05），除外照组较正常组、模型组明显升高外（P<0.05），其他处理组与模型组、正常组之间无差异（P＞0.05）。见表 4。

表4 各组大鼠24h 尿微量白蛋白变化（mg/L，）

表4 各组大鼠24h 尿微量白蛋白变化（mg/L，）

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

组别 n 4 周末 8 周末正常对照组 8 4.908±3.9569 4.934±3.5438模型组 8 8.182±2.9979* 5.989±4.4301外照组 8 4.612±3.7031 10.395±4.9801*△频谱水组 8 4.273±4.4167 6.720±3.5725盐酸二甲双胍组 8 2.838±1.8829△* 5.688±3.0978

2.5 肾组织病理学观察 大鼠肾组织HE 染色结果显示，正常组的大鼠肾小球、肾小管结构清晰，间质毛细血管丰富（图1A）。模型组的大鼠见部分肾小球系膜基质增多，肾小管上皮细胞出现细胞水肿，有的可见明显空泡，部分肾小管可见蛋白管型，肾间质有炎细胞浸润（图1B）。外照组、频谱水组、均可见肾小球有轻度系膜基质增生，部分肾小管上皮细胞空泡变性，部分肾小管上皮细胞萎缩（图1C、D）。盐酸二甲双胍组大鼠的肾小球结构较清晰，肾小管上皮细胞有轻度细胞水肿，胞浆染色呈颗粒状（图1E）。

图1 各组大鼠肾组织HE 染色（20×）

图2 各组大鼠肾组织超微结构（11 500×）

大鼠肾组织透射电镜结果显示，正常组肾小管上皮细胞线粒体丰富，结构清晰正常，粗面内质网膜上附着大量核糖体（图2A）。模型组肾小管上皮细胞线粒体数量减少且受损严重，线粒体肿胀，膜破裂，线粒体嵴缩短、溶解、消失，粗面内质网减少、变短，膜上核糖体大量脱落（图2B）。外照组、频谱水组、盐酸二甲双胍组肾小管上皮肾细胞线粒体较丰富，结构清晰正常，粗面内质网膜上附着大量核糖体（图2C、D、E）。

3 讨论

STZ 已成为目前广泛采用的糖尿病动物模型的化学诱导剂，通过损坏胰岛β 细胞，使其坏死，胰岛素分泌不足而产生糖尿病的临床症状。本实验中，模型组血糖明显高于正常对照组，表明模型成功。当高血糖达到一定程度后，能够导致各靶组织出现功能改变及病变［2］。糖尿病肾病是糖尿病临床常见的并发症，是一种由于高血糖导致的，持续性的肾脏损害，其特点表现为持续的白蛋白尿及不断下降的肾小球滤过率（GFR）［3］，GFR 是评价肾脏滤过功能的最重要的指标之一，是指单位时间内从肾小球滤过的血浆容量（mL/min）。由于人体内的肾小球数目众多，无法直接测定GFR［4］，因此通常通过血肌酐等简便易得的临床检测指标进行估算，同时根据2010 年肾脏病理学会（RPS）国际专家组提出的糖尿病肾病病理分级标准［5］，对肾脏组织光镜、免疫荧光和电镜下组织病理学的改变对肾小球、肾小管、肾间质以及肾脏血管和小动脉的透明硬化等病理状况进行评价，从而对糖尿病肾病的情况进行综合评价。骏丰频谱治疗保健仪发射的红外频谱范围广，具有改善局部血流循环，减轻肌肉紧张，解除肌肉痉挛等生物医学效应。红外线可深入组织，由照射部位温度和局部血管扩张引起的热效应，血液循环速度加快［6］。通过红外频谱照射，能够有效促进大鼠周身血液循环，同时使肾动脉及肾小血管扩张，使单位时间内通过肾脏的血流量增加，在一定程度上缓解了GFR 的下降，对于恢复GFR 有一定积极作用。李雁等［7］针对频谱水的安全评价发现，频谱水安全、无毒，能够提高机体免疫力［8］，且频谱水在一定程度上可以降低红细胞、血小板聚集、减轻血管内皮水肿程度，改善血管内皮损伤、出血等微循环障碍［9］。由于糖尿病大鼠肾小球系膜增生，肾小球毛细血管硬化，足细胞等结构的缺失融合，因此在通过频谱水治疗后，可能在一定程度上通过对血管内皮的保护作用以及对微循环的改善，恢复GFR，维持肾小球及肾小管结构，保护肾单位，缓解蛋白尿及血尿的发生。本研究结果表明，糖尿病大鼠模型进行饮用频谱水或者红外频谱照射8 周，在一定程度上可以降低糖尿病大鼠模型血清肌酐和尿酸水平，但是不能有效降低24h 尿微量白蛋白，并且可以减轻糖尿病大鼠模型的肾小管上皮细胞变性，维持肾小管上皮细胞线粒体与粗面内质网结构。

综上所述，红外频谱照射或饮用超低频电磁场处理水可以改善糖尿病模型大鼠空腹血糖水平，可以改善肾脏功能，其机制可能是通过改善细胞内能量代谢及扭转内质网应激状态来起到保护肾功能的作用。