电化学分析法检测环境中抗生素药物的研究进展

郭 瑞，崔欣阳，路 迎，顾婷婷

（辽宁科技大学 化学工程学院，辽宁 鞍山 114051）

抗生素是由某些高等动植物或微生物在生产及生活过程中产生的，对某些其他病原微生物具有抑制或杀灭作用的一类化学物质［1］。从Alexander Fleming 在1928 年发现青霉素以来，抗生素一直被广泛使用［2］，临床上多用于呼吸系统、消化系统和生殖系统感染的治疗，也作为兽药用于动物疾病预防、降低死亡率和促生长等。目前已经发现的抗生素有400 多种［1-4］，如吡嗪酰胺、纳替沙星、红霉素、环丙沙星等。抗生素的滥用会对环境以及人类的生产生活带来很多不良反应以及严重的后果，如过敏反应、对病毒产生耐药性等［5-7］。因此，对环境中抗生素药物进行痕量检测是十分必要的。

目前，抗生素的检测方法主要有：高效液相色谱分析法［4］、液相色谱-质谱联用分析法［8］、气相色谱-质谱联用法［9-11］、毛细管电泳分析法［12-13］、酶联免疫法［14-15］、生物传感器分析法［16-17］以及电化学分析法［18-20］。其中，电化学分析法由于具有仪器结构简单、操作方便、灵敏度与准确度高、选择性好以及无标记等优点，近年来被越来越多地用于环境中抗生素药物的检测［21-22］。本文对直接和间接电化学检测抗生素药物的研究进展进行了综述。

1 直接电化学检测抗生素药物的研究进展

直接电化学分析法检测的抗生素药物一般本身具有电化学活性，这些药物在结构上大部分具有羧基基团，如吡嗪酰胺、纳替沙星等，或含有甲氧基，能在电极表面直接发生氧化还原反应，通过特征峰的电流值实现对目标物的定量分析，如图1所示。被测药物浓度低时，需要进行电信号的有效放大，可以利用纳米材料（如纳米金刚石、纳米粒子、碳纳米管等）有效增加电极的表面积，提高电化学检测的灵敏度［23-25］。同时，纳米材料修饰后的电极携带的-COOH、-OH、-NH2基团会增多，提供的电化学反应位点增加，对某些抗生素药物可以产生电催化作用［26］。

图1 直接电化学检测原理图Fig.1 Schematic diagram of direct electrochemical detection

Simioni 等［19］采用方波伏安法检测吡嗪酰胺，同时利用纳米金刚石膜修饰玻碳电极增大电极比表面积，对吡嗪酰胺的检测限达到0.22 μmol/L。Aftab 等［27］用伏安法测定纳替沙星，利用氨基化的多壁碳纳米管和二氧化钛纳米粒子修饰玻碳电极，不仅增大了电极表面积，同时该修饰电极对药物表现出良好的电催化氧化性能，在1.09 V 出现明显的氧化峰，检测限达到0.169 nmol/L。

利用分子印迹聚合物可以提高电极表面抗生素药物的吸附量，从而增大被测药物的电化学信号。分子印迹聚合物是对特定的目标物及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附作用的聚合物。如间苯二胺对红霉素显示出较高的结合能力［28-29］。Ayankojo 等［30］用间苯二胺制备红霉素的分子印迹聚合物，利用其对红霉素的特异性识别将被测药物结合到电极表面，用差分脉冲伏安法检测电极表面红霉素在0.72 V 的氧化峰电流，检测限为 0.12 nmol/L，如图 2 所示。Bagheri 等［31］利用分子印迹聚合物和纳米材料二者间的协同作用，制备磁性分子印迹修饰电极检测环丙沙星，用差分脉冲伏安法检测环丙沙星，得到的检测范围为0.005~0.850 μmol/L，检出限达到1.7 nmol/L。

图2 红霉素检测原理图Fig.2 Principle diagram of Erythromycin detection

2 间接电化学分析法检测抗生素药物的研究进展

间接电化学分析法检测的抗生素药物一般本身不具备明显的电化学活性，如青霉素、磺胺嘧啶、四环素等。间接检测抗生素药物的原理是构建电化学传感器，将抗体、适配体或者DNA 等药物特异性识别物质固定到电极表面，在系统中添加电化学物质，如对苯二酚、普鲁士蓝等，当药物与识别元件特异性结合后，通过检测电化学信号响应间接测定抗生素药物的含量。电化学传感器按照识别元件的不同，可以分为电化学适配体传感器、电化学免疫传感器和分子印迹电化学传感器等。

2.1 电化学免疫传感器检测抗生素药物

电化学免疫传感器是基于抗原抗体特异性反应，以抗原或抗体为识别元件，通过电极将浓度等信号转换为电化学信号的一类电化学生物传感器。依据输出信号的不同，可以分为电流型、电位型、电阻型等免疫传感器［32］。该传感器适用于免疫物质的痕量分析，特异性好，灵敏度高，适合应用在医药卫生、食品安全、环境监测等领域。

李建龙［33］将青霉素抗体作为识别元件修饰在电极表面，利用对苯二酚作为电子媒介体（电活性物质），青霉素与抗体结合阻碍对苯二酚在电极表面的电子传递，抗体上修饰的辣根过氧化物酶催化过氧化氢进一步放大电流信号，如图3所示。该传感器在青霉素抗原质量浓度为0.05~5.00 μg/L时呈线性，检测限低至1.05 μg/L。Ionescu 等［34］利用环丙沙星抗体修饰的聚吡咯-NHS 电聚合膜实现无试剂化和无标签检测环丙沙星的电阻型电化学传感器。该系统在含有电活性物质［Fe（CN）6］3-/4-的pH 7.00磷酸缓冲溶液中进行电化学阻抗检测，由于药物与抗体结合，阻抗随药物浓度增加而增大，在低频范围内尤其明显，检测限低至10 pg/mL。

图3 免疫传感器的组装和检测Fig.3 Assembly and detection of immunosensor

电化学免疫传感器检测过程耗时短，操作简单，由于抗原抗体的特异性结合作用，使得传感器的特异性强，灵敏度高。抗原抗体在电极表面固定的稳定性、保持探针的优异性能从而实现目标物的精确测定仍是需要进一步研究的问题［35-36］。

2.2 电化学适配体传感器检测抗生素药物

适配体是指一段经过体外筛选得到的寡核苷酸序列或短多肽，能与相应的目标物质进行特异性和高亲和力结合［37-38］。电化学适配体传感器以适配体和药物分子特异性结合为基础，将适配体作为识别元件，通过电极将适配体与药物分子特异性结合，产生的信号转换为电信号，从而实现对目标物的检测［39］。Bai 等［40］开发了一种基于核酸适配体的电化学生物传感器，用于检测磺胺嘧啶，检测原理如图4 所示。磺胺嘧啶在溶液中与用于识别与捕获磺胺嘧啶的核酸适配体，形成稳定的复合物，适配体不能再与电极表面互补单链DNA 杂交形成双链DNA，电极表面的单链DNA 进一步被核酸酶P1 水解消化，抗双链DNA抗体不能特异性结合，使得空间位阻降低，电活性物质［Fe（CN）6］3-/4-在电极表面的电化学信号增强。该方法在0.1~500 nmol/L 浓度范围内可线性检测磺胺嘧啶，检测限低至0.038 nmol/L。

图4 电化学适配体传感器用于磺胺二甲氧嘧啶检测原理图Fig.4 Schematic diagram of electrochemical aptamer sensor for sulfadimethoxine detection

Wang等［41］设计并通过亚胺键缩合1，3，6，8-四（4-甲酰基苯基）吡啶和三聚氰胺，合成了一种新型共价有机骨架（Py-M-COF），通过л-л堆叠和静电相互作用，固定识别的恩诺沙星和氨苄青霉素的适配体，通过检测电活性物质［Fe（CN）6］3-/4-的电阻信号变化检测目标物的含量，原理如图5所示。恩诺沙星和氨苄青霉素存在时，会与适配体结合形成折叠，由于带负电的适配体和带负电的电活性物质之间的静电排斥作用，会观察到阻抗变大。该传感器对恩诺沙星检测范围为0.01~2 000 pg/mL，检测限低至6.07 fg/mL；对氨苄青霉素的线性范围为0.01~1 000 pg/mL，检测限为0.04 fg/mL。该传感器在人血清样品中的适用性检测都有较好的回收率。共价有机骨架是排列有序的晶微孔聚合物，具有很大的比表面积，能较好地引入作为分子识别物质的适配体，从而实现检测信号的放大［42-44］。

图5 基于共价有机骨架的适配体传感器对恩诺沙星和氨苄青霉素的检测Fig.5 Detection of enrofloxacin and ampicillin by aptamer sensor based on covalent organic framework

Wang 等［45］利用三螺旋的适配体与目标物四环素具有牢固亲和力特性，特异性识别四环素，释放的DNA 触发器启动催化发夹反应进行信号放大，反应使发夹结构中电化学活性物质二茂铁修饰的DNA 杂交成双螺旋，二茂铁通过核酸酶剪切释放和β-环糊精主客体识别吸附在电极表面，将药物信号通过电化学信号转递出来，原理如图6 所示。该方法检测四环素的线性范围为0.2~100 nmol/L，检测限为0.13 nmol/L。催化发夹结构进行信号放大的电化学检测能够快速有效地增强信号，灵敏度高，背景低［46-47］。但是大多数基于DNA 电路的细胞内功能存在生物递送和降解困难的缺点。

图6 四环素检测原理图Fig.6 Principle diagram of Tetracycline detection

Cao 等［48］提出一种电化学转换方法，将磁性Fe3O4纳米粒子转换成电活性物质普鲁士蓝（PB），用于检测氯霉素的电化学适配体传感器。该方法是将适配体修饰的磁性Fe3O4纳米粒子结合到金电极上捕获氯霉素，通过电化学转换方法，使用高低电位差激发大量的铁离子，由于Fe3+和Fe2+之间的价态转换，从而有效地生成普鲁士蓝，目标物氯霉素的含量通过普鲁士蓝的电化学信号间接检测，检测的线性范围为1~1 000 ng/mL，检出限（S/N=3）为1 ng/mL。该方法不借助任何外部条件，将纳米粒子的磁性、化学和电化学性能结合起来检测，灵敏、简便、高效。

电化学适配体传感器虽然具有检测限低、特异性强、能够实现现场快速检测等优势，很多学者在电化学适配体传感器的研究上也取得了一些成绩，但是该传感器中适配体的筛选与验证较为复杂，且该传感器在理想实验条件下性能优异，周围环境等条件的改变会直接影响其稳定性及靶标效率。因此，电化学适配体传感器的实际应用仍存在很多问题，面临很多挑战［49-50］。

2.3 DNA电化学传感器检测抗生素药物

DNA 电化学生物传感器是以DNA 为识别元件，将目标分析物的生物检测信号通过电化学转换器（电极）以电化学信号在计算机上输出的传感装置。DNA电化学生物传感器检测抗生素药物主要基于有机小分子物质与DNA 之间的特异性识别作用［51］。He 等［52］设计了一个 15 分子聚胞嘧啶的双嵌段DNA，用于卡那霉素的高灵敏度特异性检测。双嵌段DNA 被设计成固定探针，用以吸附石墨烯和识别目标卡那霉素，无需标记。在含有电活性物质［Fe（CN）6］3-/4-的缓冲溶液中进行循环伏安检测，加入卡那霉素时，［Fe（CN）6］3-/4-的电化学响应降低。该传感器对卡那霉素的线性范围较宽，达到0.05 pmol/L~100 nmol/L，检测限低至0.0476 pmol/L，在牛奶实际样品中检测有较高的回收率。本课题组［53］基于抗疟药物（奎那克林）对DNA-Cu（II）络合物的电催化活性的抑制作用，开发了一种新型的药物-双链DNA 相互作用安培分析法。根据电流-时间曲线得出，该传感器对20 μmol/L 奎那克林的响应时间为20 s，检测限低至10 μmol/L。

电化学DNA 生物传感器制作较为简单，灵敏度高，重现性好，研究热点集中于多目标同时检测和传感器的设计优化方面。电化学DNA 生物传感器有望成为电化学检测领域的重要手段之一。

3 结 论

由于人类对抗生素的使用量只增不减，因此对抗生素的检测也带来了新的挑战。电化学传感器具有操作简单、灵敏度高、成本低廉、耗时短、有特异性等优势，一直在抗生素检测领域扮演着愈发重要的角色。电化学传感器检测抗生素还有许多亟待解决的问题。纳米材料因其特殊的力学性能、比表面积等优势，用于电极的改性，可提高传感器的检测性能，但纳米材料与修饰电极的结合容易脱落，应更好地完善纳米材料与修饰电极的结合。要不断尝试电化学传感器联用其他检测手段检测抗生素药物，提高传感器的精确度，扩大传感器的检测范围。