NLRP3 和Caspase-1 在颞下颌关节骨关节炎滑膜中的表达

李艳艳， 冯亚平， 柯 金， 龙 星

（武汉大学口腔医院口腔颌面外科，湖北 武汉 430079）

颞下颌关节骨关节炎 （temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）是一种以关节软骨破坏、软骨下骨退行性改变和滑膜炎症为主要病理特征的慢性疾病，会导致关节区疼痛、张口受限，甚至面部畸形，严重影响患者的日常生活[1]。 近来的研究表明，滑膜炎与关节软骨及软骨下骨的退行性病变密切相关[2-3]。 因此，研究TMJOA 患者滑膜炎性分子表达的变化也尤为重要。

NLRP3 炎症小体 （NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3 inflammasome）是NOD 样受体 （nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）家族的重要成员，存在于细胞质中。NLRP3 炎症小体由NLRP3、 凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和胱天蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-1）前体3 种蛋白组成。 NLRP3 受到刺激，构象发生改变而活化， 与ASC 通过热蛋白结构域连接，招募pro-Caspase-1 通过胱天蛋白募集域连接ASC和pro-Caspase-1， 产 生 活 化 的Caspase-1 p10 和Caspase-1 p20， 随后将pro-IL-1β 和pro-IL-18 剪切为活化和分泌形式的IL-1β 和IL-18，细胞因子启动或者扩增不同的下游信号通路，导致炎症的级联放大[4]。 NLRP3 炎症小体的活化在许多疾病，如IgA 肾病和类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RS）等的病理发展中发挥着重要的作用[5-6]。 然而，目前还不清楚在TMJOA 滑膜炎中是否涉及NLRP3/Caspase-1/IL-1β 轴的活化。 因此，本实验将对颞下颌关节滑膜细胞中的NLRP3 和Caspase-1 的表达进行研究，以期进一步阐明TMJOA 的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1取材 在患者知情同意情况下采集滑膜样本，研究方案经武汉大学口腔医院批准。 取8 例根据临床表现、 口腔检查和影像学检查确诊为TMJOA，并需要进行关节手术患者的滑膜组织，其中男性，3 例，女性，5 例，另取3 例髁突肥大患者的滑膜组织作为对照组，患者年龄均在20～55 岁。

1.1.2主要试剂 磷酸盐缓冲液 （phosphate buffer saline，PBS）、高糖培养基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清（Hyclone 公司，美国）；RIPA（radio immunoprecipitation assay）裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（Biosharp 公司，中国）；逆转录试剂盒、Trizol 试剂（TaKaRa 公司，日本）；兔抗NLRP3 单克隆抗体、 兔抗Caspase-1 单克隆抗体和羊抗兔二抗（Abcam 公司，美国）；鼠抗肌球蛋白（β-actin）多克隆抗体和羊抗鼠二抗（武汉三鹰生物技术在限公司， 中国）； 增强发光法 （enhanced chemiluminescenece，ECL）显影液（上海碧云天公司，中国）。

1.2 方法

1.2.1滑膜细胞的培养 根据蔡恒星等[7]的经验方法进行滑膜细胞分离和培养，注意无菌操作。 具体步骤： 用含100 U/mL 链霉素和100 mg/L 青霉素的无菌PBS 冲洗取材组织，直至溶液澄清。 将其剪成1 mm×2 mm 大小的组织块， 置于25 mL 培养瓶的瓶底， 使其分散均匀。 用含有20%胎牛血清的DMEM 培养基润湿组织块， 于37 ℃、95%O2和5%CO2培养箱中培养。定期观察并换液，待细胞生长融合至密度达80%左右进行传代。

1.2.2实时定量聚合酶链式反应 （real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）法测定滑膜组织中NLRP3 和Caspase-1 mRNA 的表达 取培养3 代以内的滑膜细胞，PBS 冲洗3 遍后加入Trizol试剂，置于摇床上5 min，将提取的总RNA 转移到无酶微型离心管中并检测纯度，按照逆转录试剂盒上的说明合成模板cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq进行RT-PCR。 引物以β-actin 为内参，引物序列见表1。反应条件：①95 ℃30 s；②PCR 反应，GOTO：39（40 Cycles），60 ℃30 s；③熔解曲线，每例样品设置3 个平行复孔， 按照2-ΔΔCt法获得滑膜细胞的NLRP3 和Caspase-1 基因表达量。

表1 RT-PCR 基因引物序列表Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.2.3Western blot 检测滑膜细胞中NLRP3、Caspase-1 蛋白表达 取培养3 代以内的滑膜细胞，PBS 洗涤3 次，吸干，加入RIPA 裂解液反应，迅速刮下细胞转移到预冷离心管中，以上操作均在冰上进行。 在4 ℃下14 000×g离心10 min 收集蛋白，检测蛋白浓度。 加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，振荡器上振荡均匀，在95 ℃加热装置上变性蛋白。洗净并晾干玻璃板后垂直夹紧，放置并灌胶，待胶凝固后，每孔加入20 μg 的蛋白样品，然后电泳分离蛋白。 将蛋白从胶中电转移到聚偏二氟乙烯（poly-vinylidene fluoride，PVDF）膜 上。 根 据NLRP3、Caspase-1 和β-actin 的蛋白分子量将PVDF 膜切成条带， 置于洗净并标记好的盒子里，TBST 漂洗5 min。 加入封闭缓冲液室温摇动60 min，TBST 漂洗3 次， 每次5 min。按标记加入新鲜配制的一抗， 分别是兔抗NLRP3单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗Caspase-1 单克隆抗体（1∶100）及鼠抗β-actin 多克隆抗体（1∶500），4 ℃中轻轻摇动过夜后，TBST 漂洗3 次，每次5 min。 加入新鲜配制的二抗，室温摇动60 min，TBST 漂洗3 次，每次5 min。 加入增强发光显影液ECL 后在扫描仪中成像， 用Image J 软件分析条带上的NLRP3 和Caspase-1 蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。 数据采用均数±标准差（±s）表示，用独立样本t检验比较两组的差异，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR 检测结果

RT-PCR 的结果见图1。 按照2-ΔΔCt法分析，NLRP3 和Caspase-1 mRNA 在TMJOA 滑膜细胞中的表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 RT-PCR 显示NLRP3 和Caspase-1 基因在颞下颌关节滑膜细胞中的表达量Figure 1 The gene expression level of NLRP3 and Caspase-1 in TMJ synovial cells by RT-PCR

2.2 Western blot 检测结果

Western blot 结果表明，TMJOA 滑膜细胞中NLRP3 和Caspase-1 的蛋白表达水平显著高于对照组，且差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。

图2 Western blot 检测颞下颌关节滑膜细胞中NLRP3 和Caspase-1 的蛋白表达情况Figure 2 The protein expression of NLRP3 and Caspase-1 in TMJ synovial cells by Western blot

3 讨论

多项研究认为滑膜炎出现在TMJOA 的各个时期，并且是导致关节疼痛和下颌运动障碍的重要原因[8]。 滑膜炎产生一系列促炎细胞因子，其中IL-1β和TNF-α 是研究最为广泛的因子，在骨关节炎（osteoarthritis，OA）的滑膜、滑液、关节软骨和软骨下骨中均有升高，导致软骨分解代谢[9]。

NLRP3/Caspase-1 炎症复合体通路在固有免疫防御反应中发挥重要的作用，目前研究主要集中于免疫细胞。 本实验分别从基因和蛋白2 个方面证明在TMJOA 患者的滑膜细胞中存在NLRP3 炎症体和Caspase-1， 且两者的表达与对照组相比显著升高。 为进一步研究TMJOA 滑膜细胞中的NLRP3/Caspase-1 炎症复合体的激活和调节打下基础。

NLRP3 炎性小体的活化需要启动和激活2 个连续步骤：第一步是通过Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）或者细胞因子识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和宿主源性的危险信号（danger-associated molecular patterns，DAMPs）， 激活NF-κB 信号通路， 启 动NLRP3 炎性小体和IL-1β 等前体蛋白的转录翻译；第二步是NLRP3 的激活剂触发NLRP3 发生寡聚化并活化Caspase-1， 导致IL-1β 和IL-18 的加工和释放。 同时，IL-1β 可作用于NF-κB 信号通路， 促进NLRP3 炎性小体通路的活化，从而导致正反馈级联扩大效应[10]。

目前关于NLRP3 炎性小体的激活， 普遍认同的机制包括线粒体活性氧的产生、 钾离子外排流出、溶酶体膜的破坏导致组织蛋白酶释放和细胞器的空间定位[11]。研究认为，巨噬细胞的胞外腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）激活细胞膜上的ATP-门控离子通道P2X7 嘌呤能受体，迅速打开K+通道外排K+，招募pannexin-1 半通道蛋白形成膜孔，使细胞外的NLRP3 激活剂进入细胞质内，直接激活NLRP3[12-13]，进而活化Caspase-1，释放成熟的促炎因子IL-1β， 而IL-1β 可以刺激滑膜细胞释放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）快速促炎，同时抑制软骨细胞增殖， 降低蛋白多糖和胶原的合成，导致滑膜炎症和软骨的破坏[14]。以往研究得知颞下颌关节滑膜细胞包括A 型细胞和B 型细胞，A 型细胞为巨噬细胞样细胞，B 型细胞为成纤维样细胞[15]。 因此我们猜测，这种NLRP3 激活方式可能存在于TMJOA 的滑膜中并导致滑膜炎症。

另外， 研究者们发现NLRP3/Caspase-1 介导炎症反应的同时介导一种新型细胞程序性坏死—细胞焦亡（pyroptosis）[16]。胞质内激活的NLRP3 炎症体可以活化Caspase-1、 活性形式的Caspase-1 切割其底物gasdermin D（GSDMD）的N 端蛋白，释放的N端蛋白结合细胞膜并寡聚形成孔道状结构，使细胞内容物释放，引起细胞离子浓度梯度消失和细胞渗透溶胀，触发细胞焦亡[17]。细胞焦亡一方面对先天免疫防御至关重要，帮助机体应对病原体感染，另一方面炎性小体异常或过度活化与很多疾病相关。 近来许多研究认为细胞焦亡与肝组织、肺组织和滑膜组织等组织纤维化相关， 形成焦亡-慢性炎性反应-纤维化轴样病理过程。 有研究发现膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）的滑膜成纤维细胞和滑膜巨噬细胞均可在KOA 中发生细胞焦亡， 产生炎性因子，且通过转染滑膜成纤维细胞沉默GSDMD 后，可显著降低成纤维标志物的表达，提示成纤维滑膜细胞焦亡介导滑膜炎症反应并加剧纤维化[18]。 本实验发现TMJOA 患者的滑膜细胞中，NLRP3 和Caspase-1 的表达水平显著升高，而NLRP3 和Caspase-1在细胞焦亡相关通路中发挥重要的作用，这些都提示细胞焦亡很可能参与了TMJOA 的发生、发展，这将是本课题下一步的研究目标。