鞘内注射ETAR拮抗药对大鼠骨癌疼痛改善情况及其对ERK通路的影响

何远山,苏 宏,伊国恩,张 敏,徐 鹏，李泽清

骨癌痛(bone cancer pain，BCP)主要是由原发性恶性肿瘤，如乳腺癌、骨癌、肺癌等中晚期继发性骨转移引起，常引起剧烈疼痛反应[1]。目前，恶性肿瘤发病率不断上升，随之引起的骨癌痛病例数不断增加，严重影响人们的生活质量[2，3]。BCP发病机制十分复杂，目前尚未完全阐明，且尚无特异性根治手段，临床约45%的BCP患者疼痛无法有效控制，因此明确BCP发病机制有助于制定有效的防治措施。内皮素A受体(endothelin A receptor，ETAR)属于特异性G蛋白偶联受体，分布于中枢神经系统细胞跨膜区。研究显示，内皮素1(endothelin-1，ET-1)可通过激活ETAR参与调控炎症痛及神经病理性疼痛，说明阻断ETAR可选择性减少传入初级伤害感受器，进而减轻疼痛作用[4]。研究认为，BCP与神经病理性疼痛机制具有相似之处[5]，但关于ET-1及其受体在BCP中的变化尚不清楚。为此，本研究通过建立BCP大鼠模型，观察鞘内注射ETAR拮抗药对BCP大鼠疼痛的影响，并初步探讨其调控机制，为临床BCP的治疗提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠，3周龄5只，体质量(60±6) g，7周龄60只体质量(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号【SCXK(京)2019-0009】；饲养于12 h/12 h明暗交替、恒温恒湿环境下，自由饮水和摄食，动物实验过程符合减少、替代和优化3R原则。

1.1.2 主要试剂和仪器 Walker256乳腺癌肉瘤细胞株，购自中国医学科学院药物研究所。ETAR受体拮抗药BQ123(美国Calbiochem公司)，RT-qPCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，BCA蛋白定量分析试剂盒(美国Thermo公司)，兔抗大鼠ET1、ETAR、细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulatory protein kinase，ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2)多抗(一抗，美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(美国Santa Cruz公司)，Von Frey电子痛阈测量仪(美国IITC公司)，医学X线摄像系统(荷兰Philips公司)，Image J图像分析软件(日本尼康公司)。

1.2 方法

1.2.1 BCP模型制备 取对数期生长Walker256细胞，调整细胞密度为1×106/ml接种至3周龄大鼠腹腔，1 ml/只，常规饲养7 d，收集腹水，1000 r/min离心5 min，取沉淀，经Hank液洗涤、去除红细胞，并用生理盐水调整细胞密度为1×108/ml备用。参照文献[6]建立骨癌痛BCP大鼠模型：腹腔注射戊巴比妥那麻醉，左后肢剃毛消毒，切开皮肤，钝性分离肌肉组织，用牙科探针在胫骨干骺端平台处打孔，避开髌韧带，采用微量注射器，注入10 μl Walker256细胞混悬液，拔出针头后用医用胶水封堵针孔，缝合并消毒伤口，分笼饲养，自由饮水和进食。

1.2.2 鞘内置管术 取60只成年雌性大鼠，腹腔注射戊巴比妥那麻醉，沿L5～6间隙作水平皮肤切口，将无菌导管经棘突间隙向头端置入约2.5 cm，并做皮下隧道，将导管封闭后固定于颈背，缝合伤口，大鼠清醒后，经导管注入2%利多卡因10 μl，30 s内出现双后肢麻痹则判定置管成功，分笼饲养，置管后3 d内腹腔注射20万U青霉素预防感染。

1.2.3 分组及干预 置管成功大鼠，随机分为假手术(sham)组、假手术+生理盐水(sham+NS)组、BCP组、BCP+ETAR拮抗药(BCP+BQ123)组。BCP组、BCP+BQ123组建立BCP大鼠模型，sham组、sham+NS同法注射等量生理盐水。造模第14天，评估机械性缩足反射阈值(pain withdrawal threshold，PWT)较注射CFA前显著降低提示建模成功，否则剔除。

取建模成功BCP组13只，BCP+BQ123组、sham组、sham+BQ123组各14只，于建模后第14天，BCP+BQ123组、sham+BQ123组分别鞘内注射30 μmol的BQ123 7 μl，BCP组、sham组鞘内注射7 μl生理盐水，以小鼠出现甩尾反应为注射成功。

1.2.4 疼痛行为学检测 鞘内注射前即刻，注射后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h分别评估各组大鼠疼痛行为学。参照文献[7]应用Von Frey痛阈测量仪检测患肢PWT值：安静环境适应20 min左右，刺激针垂直刺激跖部，序贯增加刺激强度，每种强度检测5次，每两次间隔30 s，记录使大鼠产生抬足反射的最小刺激强度作为PWT。参照文献[8]，将小鼠置于60 cm×30 cm×10 cm透明玻璃箱，记录2 min内大鼠出现自发抬足次数(number of spontaneous flinches，NSF)，记录5次平均值，每次间隔15 min。

1.2.5 胫骨X射线检查 建模第14天，末次评估大鼠疼痛行为学后，戊巴比妥那腹腔注射麻醉大鼠，固定患肢，采用医学X线摄像系统(射线强度50 kV，时间90 s)对大鼠胫骨拍片，分析X线片提示的骨质破坏情况。

1.2.6 脊髓ET1、ETAR、ERK1/2 mRNA表达量检测 X线片拍摄结束后处死各组大鼠，取L4～6节段脊髓，-80 ℃保存。取50 mg脊髓组织，组织剪剪碎后，采用Trizol法提取脊髓组织总RNA，反转录合成cDNA，并以之为模板进行实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)，按照试剂盒说明书设定反应体系，并按照反应条件：94℃预变性5 min；(94 ℃变性20 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s)40个循环扩增。以β-actin为管家基因，2-ΔΔCT为目的基因的相对表达强度。引物序列：ET1: F:5′-ACGCTAGCTGATGCTAGCTAG-3′,R:5′-ATACCATGGCTGATGCTGATC-3′;ETAR:F:5′-CCATGCACTAGCGTAGCA-3′,R:5′-GCTAGTCGATGCTGACCT-3′;ERK1/2:F:5′-TAGCTCGTAGCTGATAGCT-3′,R:5′-CCGATGCTGATGCTGATGC-3′;β-actin:F:5′-CCTAGCTAGCCTAGCTGATGC-3′, R:5′-GCTGATCCTGATGTCGTAGTC-3′。

1.2.7 脊髓ET1、ETAR、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达量检测 取50 mg脊髓组织，加入液氮进行研磨，转至离心管中，加入0.5 ml细胞裂解液，于冰上孵育20 min，12 000 r/min离心15 min(离心半径12 cm)，取上清液，进行BCA蛋白定量；取50 μg待测蛋白，加入等量上样缓冲液后，沸水浴10 min变性，再次离心后取上清液，进行SDS-PAGE电泳分离，将分离胶蛋白转移至硝酸纤维素膜上，然后将膜放入封闭液中室温封闭2 h，加入稀释一抗(1∶500)，4 ℃摇床孵育过夜，PBST洗涤3次×10 min，加入稀释二抗(1∶5000)，室温孵育2 h，洗涤后暗室曝光和显影，条带拍照后采用Image J软件进行灰度值分析，以目的蛋白ET1、ETAR、ERK1/2、p-ERK1/2灰度值与β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 注射不同时间点机械痛阈值变化 与sham组、sham+BQ123组比较，注射前BCP组、BCP+BQ123组的PWT均降低(P<0.05)，鞘内注射后0.5～3.0 h，BCP组保持不变，BCP+BQ123组先升高后降低，于1.5 h达到最高，3.0 h恢复至注射前水平(P<0.05，表1)。

表1 4组骨癌疼痛大鼠注射治疗前后PWT值比较

2.2 注射不同时间点自发抬足次数变化 与sham组、sham+BQ123组比较，注射前BCP组、BCP+BQ123组的NSF均增多(P<0.05)，鞘内注射后0.5～3.0 h，BCP组保持不变，BCP+BQ123组先减少后增多，于1.5 h达到最少，3.0 h恢复至注射前水平(P<0.05，表2)。

表2 4组骨癌疼痛大鼠注射治疗前后NSF值比较 次)

2.3 胫骨骨质变化观察 胫骨骨质X线摄像显示，sham组和sham+BQ123组胫骨骨质密度均匀、骨皮质连续无缺失(图1A)；BCP组注射后14 d出现大范围骨破坏、骨皮质缺损严重(图1C)；BCP+BQ123组股骨远端见较小骨破坏病灶，部分皮质缺损(图1B)。

图1 大鼠胫骨癌建模后14 d X线片

2.4 脊髓ET1、ETAR、ERK1/2 mRNA表达量比较 脊髓ET1、ETAR mRNA相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；ERK1/2 mRNA相对表达量组间比较，差异无统计学意义(P<0.05)。与sham组、sham+BQ123组比较，BCP组、BCP+BQ123组脊髓ET1、ETAR mRNA相对表达量均升高，且BCP+BQ123组低于BCP组，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

2.5 脊髓ET1、ETAR、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达量比较 脊髓ET1、ETAR、p-ERK1/2蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；ERK1/2蛋白相对表达量组间比较，差异无统计学意义(P<0.05)。与sham组、sham+BQ123组比较，BCP组、BCP+BQ123组脊髓ET1、ETAR、p-ERK1/2蛋白相对表达量均升高，且BCP+BQ123组低于BCP组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2和表4。

表3 4组骨癌疼痛大鼠脊髓ET1、ETAR、ERK1/2 mRNA相对表达量比较

图2 骨癌大鼠脊髓ET1、ETAR、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白免疫印迹

表4 4组骨癌疼痛大鼠脊髓ET1、ETAR、ERK1/2蛋白相对表达量比较

3 讨 论

临床调查显示，骨癌患者及1/3恶性肿瘤骨转移患者均会发生BCP，癌细胞侵袭骨骼及周围组织，可导致剧烈疼痛，并伴随脊柱稳定性降低、骨折等严重并发症，对患者身心均造成巨大影响[8]。目前，临床常应用非甾体类抗生素、双磷酸盐等药物控制疼痛反应，但效果多不理想，且不良反应明显[9,10]。因此，寻找有效的治疗靶点对BCP的防治有重要临床意义。BCP发病机制复杂，其发病特征与神经病理性疼痛相似。神经调质ET-1及其受体(ERAR、ERBR)广泛表达于中枢神经系统，动物学研究显示，神经病理性疼痛模型大鼠中枢神经系统中ERAR、ERBR基因处于过表达状态，提示ET-1可通过调控其受体参与疼痛的发生[11]，因此，ERAR可能成为BCP新的治疗靶点。

本研究通过股骨骨髓腔接种鼠源Walker456乳腺癌细胞建立BCP模型，第14天大鼠表现为PWT降低和NSF增多，X线片显示大范围骨破坏、骨皮质缺损严重，提示BCP建模成功。本研究鞘内注射ERAR拮抗药干预后，BCP+BQ123组的PWT先升高后降低，NSF先减少后增多，PWT和NSF均于1.5 h达到最高和最少，3.0 h恢复至注射前水平，且X线片显示骨破坏病灶及皮质缺损程度较BCP组减轻，提示鞘内注射ETAR拮抗药可有效改善BCP大鼠的疼痛反应。ET-1属于氨基酸多肽链，通过自分泌或旁分泌方式，与其受体结合发挥作用，ERAR是位于细胞跨膜区的ET-1受体之一，两者广泛表达于中枢及外周神经系统，在神经病理性疼痛反应中发挥重要调控作用[12]。ET-1在外周神经系统中具有致痛作用，Tang等[13]应用ET-1诱发骨转移癌痛小鼠模型，且注射ETAR拮抗药BQ123后可逆转疼痛行为，与本研究结果相似。骨癌或恶性肿瘤骨转移发生过程中，肿瘤组织通过分泌转化生长因子、肿瘤坏死因子α、内皮素等刺激性神经化学因子，激活和敏化相应受体后，将各种有害刺激通过受体转化为电化学信号，传入神经元，从而导致中枢敏化、痛阈降低等[14]。

此外，本研究发现，BCP组脊髓中ET1、ETAR mRNA和蛋白及p-ERK1/2蛋白表达量均升高，提示BCP疼痛反应与脊髓ET-1及ETAR上调有关，进一步鞘内注射ERAR拮抗药后，脊髓ET1、ETAR mRNA和蛋白及p-ERK1/2蛋白表达降低，说明ETAR拮抗药可能通过抑制脊髓ERK通路发挥抑制疼痛反应的作用。ERK信号通路是调节神经元及突触可塑性的重要通路。近年来研究发现，该信号通路在BCP发生和发展过程中发挥重要调控作用，BCP发生后该信号通路处于激活状态，而抑制该信号通路可减轻BCP疼痛反应[15]。Shenoy等[16]研究发现，生长抑素受体激动剂J-2156可通过抑制脊髓组织中ERK磷酸化水平而缓解BCP大鼠疼痛反应；Nakamura等[17]发现，过量μ-阿片受体激动剂可增加BCP小鼠ERK磷酸化水平，抑制ERK磷酸化水平可抵抗BCP小鼠疼痛效应。上述研究均说明，ERK信号通路在BCP发生及维持期间被激活。本研究鞘内注射ERAR拮抗药后，ETAR基因和蛋白表达水平及ERK1/2磷酸化水平均被抑制，疼痛行为学得以改善，说明ETAR拮抗药可能通过抑制ERK1/2磷酸化水平，抑制伤害性刺激信号的传导，阻断其传入初级神经元，从而降低中枢和外周敏化，发挥镇痛作用。

综上所述，BCP疼痛反应与脊髓ET-1及ETAR有关，鞘内注射ETAR拮抗药可有效改善BCP大鼠的疼痛反应，可能通过抑制脊髓ERK通路发挥调控作用。在进一步的研究中应设计挽回实验，证实ERAR拮抗药与ERK信号通路的因果关系，为临床中BCP的治疗提供可靠靶点。