杓唇石斛素类似物的合成及其抗炎活性

关 丽，王春阳，赵惠茹，李伟泽，冯 锋

（1西安医学院药学院，西安710021；2西安医学院临床医学院，西安710021；3中国药科大学天然药物化学教研室，南京211198）

巨噬细胞是一种来源于骨髓的单核前体细胞，它的主要特点是趋向炎症部位，通过吞噬细胞碎片而发挥抗炎作用［1］。脂多糖（lipopolysaccha⁃ride，LPS）是革兰阴性细菌外膜的主要成分，是对正常动物研究最多的免疫刺激剂之一。LPS可以通过与Toll样受体结合并激活下游信号传导级联反应来诱导强烈的全身性炎症，从而促进巨噬细胞中促炎细胞因子的分泌［2］。

石斛为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium Sw.）植物，联苄类化合物是其中的主要活性物质；过往研究了联苄类化合物鼓槌石斛素（chrysotoxine）及其衍生物在阿尔茨海默病中的药理活性［3］，而杓唇石斛素（moscatilin，MST，4，4′-二羟基-3，3′，5-三甲氧基联苄，结构式见图1）是石斛中的又一代表性联苄类结构化合物，它与鼓槌石斛素结构类似，但活性截然不同。文献报道MST具有抗肿瘤［4-9］、抑制血管新生［10］、抗突变［11］、抗炎［12］等多种生物学功能，其结构简单，药理活性广泛，引起了国内外研究者的广泛关注。

Figure 1 Structure of moscatilin（MST）

本研究以丁香醛为原料，以Wittig反应为关键步骤，通过7步反应合成了MST。在此基础上，保留A环，考虑到A环为给电子基，通过在B环引入一系列吸电子基，设计并合成12个MST类似物MST-1～MST-12，结构经1H NMR、13CNMR和ESIMS表征。采用LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型，初步研究了目标化合物的体外抗炎活性，为后续的抗炎活性机制研究提供思路。

1 合成路线

MST及其衍生物的制备如路线1所示。以丁香醛为原料，通过乙酰化保护羟基、NaBH4还原醛基、羟基卤代、与三苯基膦反应等步骤，合成膦叶立德中间体5，化合物5与取代苯甲醛缩合，得到二苯乙烯衍生物6，再经过水解脱乙酰基、催化氢化反应制得不同取代的MST类似物。

Scheme 1 Synthesis of moscatilin(MST)and its analogs MST-1-MST-12a)Acetic anhydride,CH2Cl2,DMAP,r.t.,30 min;b)NaBH4,EtOH,0°C,r.t.,30 min;c)SOCl2,Et3N,CH2Cl2,0°C,r.t.,3 h;d)PPh3,toluene,reflux,12 h;e)different substituted benzaldehyde,NaH,tetrahydrofuran,Ar,0°C,r.t.,overnight;f)CH3ONa/CH3OH,r.t.,30 min;g)H2,10%Pd/C,MeOH

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

NMRAvance-300 MHz核磁共振仪（德国Bruker公司）；ESI-MS质谱仪（美国Angilent公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；TR6000全自动酶标仪（深圳雷杜公司）。

小鼠巨噬细胞RAW264.7（中国科学院上海生命科学研究院）；脂多糖、地塞米松（美国Sigma-Aldrich公司）；硅胶GF254薄层预制板（青岛海洋化工厂）；柱色谱硅胶（上海谱振生物科技有限公司）；其他化学试剂均为市售化学纯或分析纯，一般均不经纯化处理直接使用。

2.2 化学合成

2.2.1 MST的合成

3,5-二甲氧基-4-乙酰氧基苯甲醛（2） 丁香醛（10 g，0.055 mol）和催化剂量的DMAP溶解在二氯甲烷（50 mL）中，缓慢滴加乙酸酐（6 mL，0.064 mol）。常温搅拌反应1 h后，点板发现反应完全；溶液用水洗3次（10 mL×3），有机层加无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩得白色晶体12.27 g，产率99.7%；mp：118～119℃；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：9.93（1H，s，-CHO），7.17（2H，s，H-3，H-5），3.92（6H，s，2×-OCH3），2.38（3H，s，-COCH3）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：191.1，168.1，152.8，134.3，115.0，106.0，56.3，20.4；ESI-MS m/z：225.1［M+H］+。

3,5-二甲氧基-4-乙酰氧基苯甲醇（3） 将化合物2（12.0 g，0.054 mol）溶于50 mL EtOH，冰浴条件下缓慢加入NaBH4（0.61 g，0.016 mol），室温搅拌30 min，点板监测反应完全；然后加入5%HCl调节pH至7。减压浓缩后，残渣用二氯甲烷萃取3次（10 mL×3），合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩得到白色固体11.63 g，产率96.1%；mp：98～99℃；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：6.66（2H，s，H-3，H-5），4.69（2H，s，Ar-CH2-），3.84（6H，s，2×-OCH3），2.36（3H，s，-COCH3）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：168.8，152.1，139.6，115.3，103.1，65.2，56.1，20.5；ESI-MS m/z：227.1［M+H］+。

3,5-二甲氧基-氨甲基-4-乙酰氧基苯（4） 将化 合 物3（11.0 g，0.049 mol）溶 于 二 氯 甲 烷（50 mL），冰浴先加入三乙胺（7.2 mL，0.05 mol），再缓慢滴加二氯亚砜（3.9 mL，0.05 mol）。室温搅拌3 h，溶液用蒸馏水洗3次（10 mL×3），合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩得亮黄色固体10.48 g，88.1%产率；mp：75～76℃；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：6.85（2H，s，H-3，H-5），4.73（2H，s，Ar-CH2-），3.76（6H，s，2×-OCH3），2.24（3H，s，-COCH3）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：168.3，152.0，139.4，115.0，103.2，60.7，56.1，20.4；ESI-MS m/z：227.1［M+H］+。

（4-乙酰氧基-3，5-二甲氧基苯基）三苯基氯化磷（5）化合物4（10 g，0.041 mol）和PhP3（10.8 g，0.041 mol）溶解于少量甲苯（20 mL）中，加热回流6 h，有大量白色固体析出。冷却至室温后，抽滤，红外灯烘干得白色粉末18.82 g，90.5%产率；mp：169～170℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：7.92（3H，m，ArH），7.76（6H，dt，J=3.6 Hz，8.1 Hz，ArH），7.69（6H，m，ArH），6.30（2H，d，J=2.4 Hz，H-3，H-5），5.09（2H，J=15.0 Hz，Ar-CH2-），3.37（6H，s，2×-OCH3），2.21（3H，s，-COCH3）；13CNMR（75 MHz，DMSO-d6）δ：168.4，152.0，151.9，135.5，134.8，134.6，130.6，130.4，126.7，118.8，117.6，108.5，108.5，56.2，29.4，28.8，20.6；ESIMS m/z：541.2［M+Cl］-。

4-（4-羟基-3-甲氧基苯乙基）-2，6-二甲氧基苯酚（MST）膦盐5（1.0 g，1.974 mmol）和3-甲氧基-4-羟基苯甲醛同时溶解在干燥的少量四氢呋喃（5 mL）中，氩气保护，冰盐浴冷却下缓慢加入NaH（0.056 g，2.368 mmol），加毕，常温反应过夜，浓缩反应液，得到顺反混合的二苯乙烯衍生物，减压浓缩，溶于甲醇10 mL，加甲醇钠（0.5 g，9.259 mmol）反应2 h，点板（石油醚-丙酮，2∶1）发现反应完全，说明乙酰基被脱去。用5%的HCl调pH至7，减压浓缩醇溶液，加入蒸馏水10 mL，用二氯甲烷萃取3次（10 mL×3），合并有机层，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩后用10 mL甲醇溶解。再加入20 mg 10%Pd-C催化氢化得到MST粗品。经硅胶柱色谱（展开剂：石油醚-丙酮，4∶1）纯化得MST，产率为53.2%；白色晶体；mp 94～95℃；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：6.85（1H，d，J=8.1 Hz，H-5′），6.78（1H，d，J=8.1 Hz，H-6′），6.63（1H，s，H-2′），6.38（2H，s，H-3，H-5），5.52，5.41（2H，s，ArOH），3.86（9H，s，3×-OCH3），2.83（4H，s，-CH2CH2-）；13CNMR（75 MHz，CDCl3）δ：160.2，155.8，132.4，128.5，127.8，127.3，121.1，115.0，111.8，105.1，56.2，56.1，38.1，37.6；ESI-MS m/z：327.1［M+Na］+。

2.2.2 目标化合物MST-1～MST-12的制备 按照制备MST的方式，替换不同的取代苯甲醛，所得粗品通过硅胶柱色谱（展开剂：石油醚-丙酮20∶1→5∶1）分离纯化得MST类似物。

2，6-二甲氧基-4-苯乙基苯酚（MST-1） 产率45%；无色油状；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.33～7.20（5H，m，ArH），6.37（2H，s，H-2，H-6），5.40（1H，br.s，-OH），3.86（6H，s，2×-OCH3），2.89（4H，m，ArCH2CH2Ar）；13CNMR（75 MHz，CDCl3）δ：150.1，144.8，143.1，141.8，131.9，130.5，130.2，128.1，105.1，56.3，38.7，37.3；ESI-MS m/z：281.1［M+Na］+，267.1［M-H］-。

4-（3，4-二氯苯乙基）-2，6-二甲氧基苯酚（MST-2） 产率51%；黄色晶体；mp 89～90℃；

1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.34（1H，d，J=8.1Hz，H-5′），7.27（1H，br.s，H-2′），6.98（1H，dd，J=1.8 Hz，8.1 Hz，H-6′），6.35（1H，s，H-2，H-6），5.41（1H，br.s，ArOH），3.86（6H，s，2×-OCH3），2.84（4H，m，ArCH2CH2Ar）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：148.0，146.8，142.2，141.8，131.9，130.5，130.2，128.1，105.1，56.3，37.7，37.3；ESIMS m/z：349.0［M+Na］+，325.1［M-H］-。

2，6-二甲氧基-4-（硝基苯乙基）苯酚（MST-3）产率39%；黄色油状；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：8.15（2H，d，J=8.7 Hz，H-3′，H-5′），7.31（2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，H-6′），6.34（2H，s，H-2，H-6），5.41（1H，s，ArOH），3.0（4H，m，-CH2CH2-）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：160.2，155.8，132.4，128.5，127.8，127.3，121.1，115.0，111.8，105.1，56.2，56.1，38.1，37.6；ESI-MS m/z：ESI-MS m/z：304.1［M+H］+。

4-（4-氯苯乙基）-2，6-二甲氧基苯酚（MST-4）产率36%；黄色固体；mp：103～104℃；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.25（2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-5′），7.09（2H，d，J=8.1 Hz，H-2′，H-6′），6.34（2H，s，H-2，H-6），5.43（1H，s，ArOH），3.85（6H，s，2×-OCH3），2.86（4H，m，-CH2CH2-）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：148.0，146.8，142.2，141.8，131.9，130.5，130.2，128.1，105.1，56.3，37.7，37.3；ESI-MS m/z：315.1［M+Na］+。

4-（2-氯苯乙基）-2，6-二甲氧基苯酚（MST-5）产率47%；白色固体；mp：118～119℃；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.38（1H，m，H-3′），7.18～7.11（3H，m，H-4′，5′，6′），6.39（2H，s，H-3，H-5），5.41（1H，s，ArOH），3.87（6H，s，2×-OCH3），3.05～2.84（4H，m，-CH2CH2-）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：160.2，155.8，132.4，128.5，127.8，127.3，121.1，115.0，111.8，105.1，56.2，56.1，38.1，37.6；ESI-MS m/z：315.1［M+Na］+。

4-（4-溴苯乙基）-2，6-二甲氧基苯酚（MST-6）产率32%；黄色油状；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.42～7.02（4H，m，ArH），6.37（2H，s，H-3，H-5），5.41（1H，s，ArOH），3.86（6H，s，2×-OCH3），2.95～2.85（4H，m，-CH2CH2-）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：152.2，155.8，132.4，127.5，127.8，127.3，121.1，115.0，111.8，105.1，56.2，56.1，38.1，37.6；ESI-MS m/z：359.0［M+Na］+，335.1［M-H］-。

4-（4-氟苯乙基）-2，6-二甲氧基苯酚（MST-7）产率35%；黄色固体；mp：101～102℃；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.10（2H，m，H-3′，H-5′），6.97（2H，m，H-2′，H-6′），6.34（2H，s，H-3，H-5），5.41（1H，s，ArOH），3.85（6H，s，2×-OCH3），2.85（4H，m，-CH2CH2-）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：160.2，155.8，132.4，128.5，127.8，127.3，121.1，115.0，111.8，105.1，56.2，56.1，38.1，37.6；ESIMS m/z：299.1［M+Na］+，275.1［M-H］-。

4-（2-溴苯乙基）-2，6-二甲氧基苯酚（MST-8）产率45%；黄色固体；mp：114～115℃；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.55（1H，d，J=8.1 Hz，H-3′），7.24（1H，t，H-5′），7.09（1H，d，J=8.1 Hz，H-6′），7.01（1H，t，J=8.1 Hz，H-4′），6.27（2H，s，H-2，H-6），5.79 1（1H，br.s，OH），373（6H，s，2×-OCH3），2.82（4H，m，-CH2CH2-）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：147.3，139.5，137.7，134.6，132.6，131.1，128.4，127.6，124.5，105.5，56.2，56.1，37.6，37.3；ESI-MS m/z：359.1［M+Na］+。

4-（2-氟苯基乙基）-2，6-二甲氧基苯酚（MST-9）产率51%；黄色固体；mp：93～94℃；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.21～7.01（4H，m，ArH），6.38（2H，s，H-3，H-5），5.40（1H，br.s，ArOH），3.86（6H，s，2×-OCH3），2.86（4H，m，-CH2CH2-）；13C NMR（75MHz，CDCl3）δ：157.2，154.8，132.4，128.5，127.8，127.3，121.1，115.0，111.8，105.1，56.2，38.1，37.6；ESI-MS m/z：359.1［M+Na］+。

4-（3-氟苯乙基）-2，6-二甲氧基苯酚（MST-10）产率37%；黄色油状；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.21～7.01（4H，m，ArH），6.38（2H，s，H-3，H-5），5.40（1H，br.s，ArOH），3.86（6H，s，2×-OCH3），2.86（4H，m，-CH2CH2-）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：162.8，147.3，145.5，137.7，134.6，130.2，123.3，117.2，112.7，105.8，56.1，38.0，37.5；ESIMS m/z：299.1［M+Na］+。

4-（2，4-二氯苯乙基）-2，6-二甲氧基苯酚（MST-11） 产率40%；黄色油状；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.39（1H，d，J=2.1 Hz，H-3′），7.14（1H，dd，J=1.8，8.1 Hz，H-5′），7.03（1H，d，J=8.4 Hz，H-6′），6.36（2H，s，H-3，H-5），5.43（1H，br.s，ArOH），3.86（6H，s，2×-OCH3），3.01-2.80（4H，m，-CH2CH2-）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：161.1，160.6，149.2，147.0，136.4，132.5，128.8，123.2，121.2，115.0，105.1，56.1，40.6，36.4；ESI-MS m/z：349.0［M+Na］+。

4-（2，3-二氯苯乙基）-2，6-二甲氧基苯酚（MST-12） 产率46%；黄色油状；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.34（1H，dd，J=1.5，7.8 Hz，H-4′），7.10（1H，t，J=7.8 Hz，H-5′），7.01（1H，dd，J=1.5，7.5 Hz，H-6′），5.43（1H，br.s，ArOH），3.87（6H，s，2×-OCH3），3.08～2.83（4H，m，-CH2CH2-）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：151.1，150.6，149.2，147.0，136.4，132.5，128.8，123.2，121.2，115.0，105.1，56.1，40.6，36.4；ESI-MS m/z：349.0［M+Na］+，325.2［M-H］-。

2.3 抗炎活性测试[13]

脂多糖（LPS）诱导可以激活小鼠巨噬细胞RAW264.7的诱生型一氧化氮合酶（iNOS），产生较大量的一氧化氮（NO），加入抗炎化合物后可抑制iNOS，从而减少NO的生成。本实验采用细菌脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症评价模型，考察化合物抑制NO产生的情况，阳性药为地塞米松（dexamethasone）。取对数生长期的RAW264.7细胞进行实验，按照每毫升1×106个，每孔100µL的细胞量接种于96孔板中，用MTT法测定不同浓度化合物（50，25，10，5，2.5，1.25µmol/L）的细胞毒性。确定无毒浓度后，取对数期生长的RAW264.7细胞（每毫升2×106个，每孔100µL）接种于96孔培养板中，设空白对照组，LPS模型组（终浓度为1.5µg/mL的LPS），地塞米松组（终浓度为10µmol/L地塞米松和终浓度为1.5µg/mL的LPS），5%CO2、37℃下培养24 h，收集上清液，采用Griess法检测炎性介质NO含量。每组实验重复3次，并计算IC50。

Table1 IC50 of MST-1-MST-12 on anti-inflammatory activities in vitro(±s,n=3)

Table1 IC50 of MST-1-MST-12 on anti-inflammatory activities in vitro(±s,n=3)

Compd.MST MST-1 MST-2 MST-3 MST-4 MST-5 MST-6 MST-7 MST-8 MST-9 MST-10 MST-11 MST-12 Dexamethasone Inhibition/%50µmol/L 83.72 82.69 83.41 80.82 86.89 86.80 87.25 88.97 87.12 86.41 87.11 88.15 81.25 88.12 25µmol/L 78.04 63.17 59.62 57.93 80.43 84.02 84.83 82.16 79.24 75.08 72.06 70.54 76.38 79.51 10µmol/L 47.93 48.09 17.94 28.77 50.07 85.61 55.21 52.48 60.13 61.34 54.23 59.24 67.14 49.35 2.5µmol/L 26.31 43.27 9.21 11.35 24.66 83.53 28.14 23.06 30.05 28.35 30.36 40.28 40.93 28.32 1.25µmol/L 15.43 11.54 3.91 1.20 8.22 76.67 19.38 19.01 20.41 18.74 26.97 35.79 27.04 18.12 IC50/(µmol/L)11.274±1.02 15.537±1.07 20.138±1.83 22.219±1.07images/BZ_50_995_2267_997_2269.png13.061±1.43 0.428±0.036 9.375±1.28 9.247±1.05 6.723±0.86 7.432±1.47 8.310±1.21 4.508±0.25 5.304±1.86 11.208±1.13

3 结果与讨论

本研究以丁香醛为原料，参考合成鼓槌石斛素的方法［3］，以Wittig反应作为关键步骤，通过7步反应合成了MST及其12个B环不同取代的MST类似物MST-1～MST-12。

采用LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型，初步评价了目标化合物的体外抗炎活性，结果显示所测目标化合物对NO的产生均有不同程度抑制作用。构效关系分析显示，B环2-氯取代的化合物MST-5，其抗炎活性最强，IC50达到（0.428±0.036）µmol/L；B环2，3-二氯取代的MST-11或2，4-二氯取代的MST-12，虽然抗炎活性有所减弱，但仍然高于其他化合物；2-溴取代（MST-8）和2-氟取代（MST-9）类似物的活性弱于相应的2-氯取代化合物。本研究为MST类似物的进一步结构修饰与优化提供了思路，MST-5的抗炎机制研究正在进行中。