复合激活剂对混合菌群降解活性艳蓝的促进作用及生物降解机理

王怡琴，谢学辉，郑秀林，张庆云，从军灏，刘 娜， 柳建设

(1.东华大学 a. 环境科学与工程学院；b. 国家环境保护纺织工业污染防治工程技术中心，上海 201620；2. 上海污染控制与生态安全研究院， 上海 200092；3. 宿州学院 环境与测绘工程学院，安徽 宿州234000)

印染废水具有稳定性、生物毒性和难降解性等特点，被公认为难处理的废水之一[1]。许多染料及其中间产物具有致癌、致畸、致突变性，能够破坏水生环境的生态平衡，威胁人类的健康[2]。因此，如何高效处理染料废水成为促进印染行业可持续发展的艰巨任务之一。目前，为减少染料废水的有机负荷，国际上常用物理法、化学法、生物法处理废水[3-4]。其中，生物法具有成本低、经济和环境效益良好等优点而被广泛应用[5-6]。

目前国内外学者对偶氮染料生物处理的研究较为广泛，而对蒽醌染料生物处理的研究较少。活性艳蓝19(reactive brilliant blue 19，RB19)为典型的蒽醌结构染料，具有抗化学氧化的作用，因此在印染废水中长期稳定地存在，且被生物降解的效率普遍较低[7]。如：Rybczyriska等[8]的研究中，在加入碳源的情况下，菌株Haematonectria haematococca BwⅢ43和K37对蒽醌染料茜素兰B第14天脱色率分别仅为59%和57%；Holkar等[9]的研究结果显示，当葡萄糖质量浓度为6 g/L时，菌株Enterobacter sp. F 对蒽醌染料RB19的脱色率达到最大(但脱色速率实际上仅为0.08 mg/h)。由此可见，蒽醌染料生物处理法的效率还有待提升。

激活剂作为一种可以增加酶活性、提高酶促反应速率的物质，在生物处理法中得到了越来越广泛的应用[10-11]。由于常规生物法处理效率较低，因此研究添加激活剂以提高印染废水生物处理效率具有重要意义。例如，金属盐、氧化还原介质和共代谢基质的加入能提高微生物的降解脱色能力[12-14]。有研究[15-16]指出氧化还原介体通常作为电子供体或直接增加微生物活性，以提高其脱色率，还有研究者[17]指出染料的脱色率由共代谢基质的有效性和类型决定。目前，研究者更多地关注单一激活剂对菌株脱色降解染料的促进作用，而复合激活剂对混合菌群的促进作用研究甚少，且对添加激活物质以激活功能微生物的研究大多处于宏观层面。因此，研究复合激活剂在混合菌群生物处理中的作用，并探究其作用的生物学机理显得尤为重要。本课题组前期研究[18]发现茶叶渣可作为一种激活物质促进混合菌群对RB19的降解，并提取茶叶渣中的主要成分制成一种复合激活剂。本研究通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)及液相色谱质谱联用仪(LC-MS)对激活剂作用下降解产物进行分析，并通过高通量测序和非标及定量蛋白质组学分析对激活剂作用的生物学机理进行深入研究，在印染废水生物处理中具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验选用的染料为SIGMA-ALOR-ICH公司生产的蒽醌染料RB19。培养基包含无水硫酸钠为0.5 g/L，氯化铵为0.2 g/L，磷酸二氢钾为2.66 g/L，酵母提取物为3 g/L。培养基均在121 °C灭菌20 min后冷却备用。复合激活剂包含表没食子儿茶素没食子酸酯质量浓度为 2.5 g/L，茶氨酸质量浓度为2.5 g/L，抗坏血酸质量浓度为6.5 g/L，H3BO3质量浓度为6.5 g/L，FeCl3质量浓度为4.5 g/L，MgCl2质量浓度为0.05 g/L。

本试验中使用的两种混合菌群分别为DDMY1和DDMY2[18]，均为本实验室长期驯化保存的菌种。其中，菌群DDMY1一直以来只用RB19进行培养驯化，而菌群DDMY2长期使用RB19和质量浓度为3 g/L的茶叶渣共同培养驯化。研究前期发现，混合菌群DDMY2的脱色效果优于DDMY1的脱色效果，由此推测是由茶叶渣的激活作用导致的。

1.2 试验方法

1.2.1 分光光度法测定脱色率

取2 mL脱色液，在8 000 r/min下离心10 min，取上清液在特定波长(597 nm)处的吸光值，根据波长597 nm处吸光值的变化计算脱色率。

(1)

式中：A0为脱色前597 nm 的吸光度值；At为脱色后597 nm 的吸光度值。

1.2.2 复合激活剂对混合菌群DDMY1、DDMY2脱色RB19的影响

文献[19]研究发现龙井茶叶渣对RB19的降解有促进作用，但茶叶渣对菌群的促进效果受茶叶渣晒制时间、温度等外界因素与茶叶购买批次影响，因此希望通过模拟茶叶渣中的关键成分研制一种稳定的复合激活剂。选用两种不同的混合菌群DDMY1、DDMY2进行对比，其中一组试验组不添加复合激活剂(试验组DDMY1和DDMY2)，另一组(试验组DDMY1+A和DDMY2+A)添加激活剂的接种量的体积分数为0.1%。将每个试验组做3个平行样，在37 ℃的条件下静置培养。菌液按体积分数为10%的量接种于100 mL锥形瓶中(含45 mL培养基)，其中每个锥形瓶RB19质量浓度为200 mg/L。分别在培养过程中的0、24、36、48、60、72 h取2 mL脱色液，在8 000 r/min速度下离心10 min，用分光光度法测定脱色率。

1.2.3 液相色谱质谱联用分析

将均添加复合激活剂的混合菌群DDMY1和DDMY2置于培养基中脱色质量浓度为200 mg/L的RB19，静置恒温培养72 h。取100 mL脱色液，8 000 r/min速度下离心10 min并保留上清液，将上清液用蒸馏水稀释至400 mL置于烧杯中。随后，每个试验组取2个1 kD透析袋，分别装50 mL蒸馏水和甲醇，两端封口置于烧杯中搅拌透析24 h。透析后将2个透析袋中的液体混合均匀，取2 mL透析液在12 000 r/min速度下离心10 min，并用0.22 μm水相针式滤器将上清液过滤，最后将过滤后的样品转移至2 mL色谱进样瓶中，用Agilent QTOF6520型液相色谱质谱联用仪对样品进行分析。

色谱条件为采用Agilent zorbax 300Extend-C18 4.6 mm×150 mm的色谱柱，柱填料粒径为3.5 μm。二元流动相为A相——含浓度为20 mmol/L醋酸铵的超纯水，B相——含浓度为20 mmol/L醋酸铵的甲醇。质谱条件为0.276 MPa喷雾器压力，干燥气为350 ℃氮气，流速为9 L/min。

1.2.4 高通量测序

根据文献[20]利用高通量测序对8种不同样品的菌群结构进行分析。试验中所测得的16 SrDNA基因序列已保存在NCBI GenBank中，并获得序列登录号为SRP193910。

1.2.5 蛋白质组学分析

非标记定量技术用于比较样品不经过任何标记，直接酶解后经过质谱分析产生数据。通过Thermo Xcalibur 4.0软件对谱图进行归一化后，比较对应质谱峰的强度、峰面积等一系列因素，以此来确定蛋白质在4组样本中的相对表达量变化。

2 结果与讨论

2.1 复合激活剂对混合菌群DDMY1、DDMY2脱色RB19的影响

复合激活剂对混合菌DDMY1、DDMY2脱色RB19的影响，如图1所示。

图1 复合激活剂对DDMY1、DDMY2脱色RB19效果影响Fig.1 Effect of complex activator on decolorization of RB19 by bacterial consortia DDMY1 and DDMY2

由图1可知，复合激活剂的加入能显著提高菌群DDMY1对 RB19的脱色率。试验组DDMY1+A在72 h的脱色率为77.81%，比样品DDMY1(70.57%)高7.24%。而在相同时间内，DDMY2+A的脱色率为85.16%，仅比DDMY2(83.39%)高1.77%。与DDMY1相比，复合激活剂的加入并不能显著促进DDMY2对RB19的降解，但DDMY2、DDMY2+A的脱色率整体高于DDMY1、DDMY1+A。这是由于复合激活剂的配方是模拟茶叶渣中的主要成分制成的，所以复合激活剂的加入对于经过茶叶渣驯化的菌群(DDMY2)影响较小；此外，复合激活剂加入对未经过茶叶渣驯化的普通菌种(DDMY1)脱色降解RB19有很大的促进作用。相较于文献[8]的研究，额外加入干酪素水解物菌株Haematonectria haematococca BwⅢ43和K37对蒽醌染料茜素兰B脱色率达到80%～90%需要7 d。而本试验中，复合激活剂的加入能够使菌群在短时间内对RB19有较好的脱色降解效果。由此表明，这类复合激活剂在实际印染废水处理中具有重要意义。

2.2 复合激活剂诱导下混合菌群对RB19的降解产物分析

使用LC-MS分析了激活剂诱导混合菌群DDMY1脱色RB19的降解产物。将初始未降解的RB19作为对照组，在正离子模式下观察到m∶z为625的母离子峰。经过72 h的脱色降解，母离子峰逐渐消失，且激活剂诱导下混合菌群DDMY1对RB19的降解产物在正离子模式下发现3个新的离子峰，m∶z分别为197、167、181，对应的降解产物分别为3，6-二氨基苯二甲酸、邻苯二甲酸、苯磺酸钠。激活剂诱导下混合菌群DDMY2对RB19的降解产物在正离子模式下也发现3个新的离子峰，m∶z分别为197、167、158，对应的降解产物分别为3，6-二氨基苯二甲酸、邻苯二甲酸、苯磺酸。根据LC-MS测定的降解产物并结合文献[21-24]中的试验结果，本试验推测了两种不同混合菌群降解RB19的分子转化途径，如图2和3所示。RB19在降解的过程中蒽醌环结构被打开，降解为小分子的芳香族化合物。因此，在激活剂作用下两种混合菌群能够实现染料的脱色，并将大分子有机物转变为小分子有机物，无法完全矿化，且降解产物仍有一定毒性[25-26]，需后续进一步处理。但这类方法仍不失为一种高效且成本低廉的染料预处理方法。

图2 激活剂诱导下混合菌群DDMY1降解RB19分子转化途径Fig.2 Molecular transformation pathway of RB19 degraded by bacterial consortium DDMY1 induced by activator

图3 激活剂诱导下混合菌群DDMY2降解RB19分子转化途径Fig.3 Molecular transformation pathway of RB19 degraded by bacterial consortium DDMY2 induced by activator

2.3 复合激活剂对混合菌群结构的影响

为进一步研究复合激活剂对混合菌群DDMY1、DDMY2群落结构的影响，使用RDP(ribosomal database project)分类器将序列标签分配到不同的分类水平，如图4所示。

由图4(a)可知，在门水平上8个样品具有高度的相似性，但菌种丰度不同。变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为3种主要的菌门，占每个样品中所有菌种的99%以上。其中，变形菌门在所有样品中占比最高，这说明变形菌门为RB19脱色系统中主要的菌门。文献[27]研究发现变形菌门在其他废水处理系统中占主导地位。文献[28-29]在染料废水处理中发现，拟杆菌门的菌种可以适应复杂的环境并分泌各种氧化还原酶。与样品DDMY1-初始、DDMY1驯化6个月相比，样品DDMY1+A、DDMY1+A 驯化6个月中变形菌门的含量分别多了6.00%和14.02%，而拟杆菌门的含量分别少了6.18%和16.21%。此外，样品DDMY2-初始、DDMY2驯化6个月、DDMY2+A 和 DDMY2+A驯化6个月中变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门比例具有更高的相似性。上述结果说明，复合激活剂的添加可以显著改变普通菌群(如本试验中的试验组DDMY1)的菌群结构，且能够增加在RB19脱色降解过程中发挥重要作用的变形菌门含量。同时，添加复合激活剂至试验组DDMY2中并没有显著改变其菌群结构，说明混合菌群DDMY2具有更加稳定的菌群结构，且不易受外界因素影响。由图4(b)可知，在纲水平上样品DDMY1-初始和DDMY1驯化6个月中γ-变形菌纲和β-变形菌纲的含量显著增加，而黄杆菌纲含量显著下降，其中γ-变形菌纲在所有样品中均为最主要的纲。γ-变形菌纲为革兰氏阴性菌，被发现广泛存在于染料废水处理系统中[30-31]。由图4还可以发现，样品DDMY2-初始、DDMY2驯化6个月、DDMY2+A 和DDMY2+A 驯化6个月中均存在拟杆菌纲，而在试验组DDMY1-初始中未检测到拟杆菌纲。由此可以推测，加入复合激活剂能够富集γ-变形菌纲和拟杆菌纲这类脱色RB19的优势菌纲。

(a) 门水平

2.4 复合激活剂诱导混合菌群降解RB19的蛋白质组学分析

2.4.1 肽段与蛋白质鉴定、定量结果评估

本试验采用串联质谱仪thermo scientific q-exactive进行检测。图5(a)为鉴定蛋白信息统计图。在4个样品中共检测到480 207个二级谱图，匹配了160 705个肽段，鉴定了16 754个肽段序列和5 355个蛋白质组。图5(b)为鉴定肽段序列长度分布图，大部分肽段所含氨基酸的个数为9～21个，其中含有11、12个氨基酸的肽段最多。图5(c)为肽段数量分布图，显示了鉴定到的蛋白所含肽段的数量分布情况。由图5(c)可知，蛋白质数量随着肽段数量的增加而减少，73%左右的蛋白质最多含有4个肽段。图5(d)显示蛋白质分子量，其中蛋白质分子量多数为11～20 kDa，约占蛋白质总量的22%，且80%左右的蛋白质分子量处于11～60 kDa。

(a) 蛋白信息统计图

2.4.2 激活剂诱导的蛋白差异表达

表1为分组样品DDMY1vs DDMY1+A、DDMY2 vs DDMY2+A的差异蛋白数量，显著差异表达蛋白的筛选标准为差异显著性P<0.05和两样品间表达量的比值FC<0.83或FC>1.20。由表1可知，激活剂的加入会显著影响两种混合菌群功能蛋白的差异表达，且与DDMY2对比 DDMY2+A比较，DDMY1对比 DDMY1+A差异蛋白的数量有所增加，说明激活剂对混合菌群DDMY1功能蛋白表达的促进作用强于其对混合菌群DDMY2。

表1 分组样品中不同表达蛋白的数量(P<0.05 & FC<0.83或FC>1.20)Table 1 Number of differently expressed proteins in different samples (P<0.05 & FC<0.83 or FC>1.20)

2.4.3 激活剂诱导差异表达蛋白的功能分析

利用基因本体论对不同组样品进行注释分析，其中，BP(biological process)为生物过程，CC(cellular component)为细胞组分，MF(molecular function)为分子功能。图6对不同分组对比的上调差异蛋白进行了功能注释分析。相同的蛋白质可能参与不同的生物过程，成为不同的细胞组分以及具有不同的分子功能。

图6(a)显示了DDMY1+A相较于DDMY1，前者参与生物过程的上调蛋白为2 521个，其中约有70%的上调蛋白参与了细胞过程和代谢过程。在细胞组分分类中上调蛋白的数量为1 983个，其中，膜类别和细胞部分类别蛋白含量较多，其次为膜部分类别和蛋白质复合物类别。分子功能中上调蛋白数量为2 674个，其中多数具有催化活性和结合分子功能，占上调蛋白的78%，其次为结构分子活性和转运功能。

图6(b)显示了相较于DDMY2，DDMY2+A参与生物过程的上调蛋白数量为2 227个，约有68%的上调蛋白参与了细胞过程和代谢过程。在细胞组分分类中上调蛋白数量为1 809个，其中，细胞部分类别和膜类别蛋白含量较多，其次为膜部分类别和蛋白质复合物类别。分子功能中上调蛋白的数量为1 950个，约有77%具有催化活性和结合分子功能，其次为结构分子活性和转运功能。

图6 在激活剂诱导下不同混合菌群上调差异蛋白的基因本体论分析Fig.6 Gene ontology analysis of up-regulated differential proteins in different bacterial consortia induced by activators

2.4.4 差异表达蛋白KEGG通路分析

在生物体内，基因产物并不是孤立存在作用的，不同基因产物之间通过有序地相互协调来行使具体的生物学功能。为从系统水平了解差异蛋白的生物学功能，对鉴定的差异蛋白KEGG通路进行注释。图7显示了两项分组样品DDMY1 vs DDMY1+A、DDMY2 vs DDMY2+A差异蛋白前30条注释结果。在激活剂诱导下两种不同混合菌群DDMY1、DDMY2差异蛋白参与的KEGG通路最主要为代谢途径、次生代谢产物的生物合成、抗生素的生物合成、碳代谢。分组样品DDMY1 对比DDMY1+A与分组样品DDMY2对比DDMY2+A的KEGG通路基本相同，说明激活剂对两种不同混合菌群差异蛋白表达的作用类似。除了上述的通路外，苯甲酸的降解途径也得到了丰富，且苯甲酸酯降解的代谢产物被认为可用于脂肪酸、氨基酸代谢等富集途径[33]。上述LC-MS试验中已检测到降解中间体及产物中存在苯甲酸类物质。因此，推测RB19被先降解为苯甲酸酯，随后进一步进行糖酵解、柠檬酸循环等[34]。与分组样品DDMY2对比DDMY2+A相比，分组样品DDMY1对比DDMY1+A中前30组代谢途径中活跃的差异蛋白均更加丰富，说明激活剂对混合菌群DDMY1的影响大于其对混合菌群DDMY2的影响的促进作用。

图7 在激活剂诱导下不同混合菌群差异蛋白的KEGG通路Fig.7 KEGG pathway of differential proteins of different bacterial consortia induced by activator

3 结 论

(1) 本文以混合菌群DDMY1、DDMY2为对象，研究了激活剂对两种混合菌群的促进作用，结果表明复合激活剂的加入对DDMY1的促进作用优于其对DDMY2的作用。

(2) 由LC-MS测定结果可知，在激活剂诱导下混合菌群DDMY1对RB19的降解产物主要为3，6-二氨基苯二甲酸、邻苯二甲酸、苯磺酸钠，而在激活剂诱导下混合菌群DDMY2对RB19的降解产物分别为3，6-二氨基苯二甲酸、邻苯二甲酸、苯磺酸。

(3) 高通量测序结果表明激活剂可简化群落结构，且能够富集肠杆菌属，这可能是增强混合菌群对RB19脱色降解的原因。从生物过程角度分析，两组分组样品DDMY1 vs DDMY1+A、DDMY2 vs DDMY2+A的上调蛋白均大部分参与了细胞过程和代谢过程。在细胞组分分类中，激活剂对菌群DDMY1在差异蛋白表达上影响更大。分组样品大多数的上调蛋白均与催化活性、结合分子功能相关。在激活剂诱导下两种不同菌群DDMY1、DDMY2差异蛋白参与的KEGG通路前4条为代谢途径、次生代谢产物的生物合成、抗生素的生物合成、碳代谢，同时，苯甲酸的降解途径也得到了证实。