基于点击化学的壳聚糖水凝胶的制备及性能

徐思诗，郎美东

(华东理工大学材料科学与工程学院，上海 200237)

1 引 言

水凝胶作为一种具有高吸水和保水性的高分子交联网络材料，在生物医学领域有着十分广泛的应用。由于生物医用材料在无毒性、生物相容性和生物可降解性方面有着十分严格的要求，研究者们常采用天然大分子如多糖、多肽、蛋白质等作为水凝胶的主链结构[1-3]。壳聚糖(CS)是一种由甲壳素脱乙酰基得到的天然碱性多糖，能够溶于酸性溶液，具有优异的无毒性、生物粘附性、抗菌性及生物可降解性[4-6]。

CS水凝胶可分为官能化改性后通过共价键交联形成的化学水凝胶，以及通过静电作用力形成的物理水凝胶[7-9]。Li等[10]用氯乙酸将壳聚糖羧甲基化制得N，O-羧甲基壳聚糖(NOCC)，同时利用糖单元保留的部分氨基与氧化透明质酸(OHA)的醛基发生席夫碱反应，形成一种可注射原位交联NOCC-OHA 水凝胶。Birch等[11]在中性条件下利用果胶和CS制备了一种用于创口敷料的温敏性聚电解质复合水凝胶CS/Pec，其储能模量G'会随温度的升高逐渐减小。然而其G'max也小于1000 Pa，凝胶强度有待加强。另外，多数改性CS水凝胶的凝胶时间长达几小时甚至几天，制备方法颇为复杂，这使其投入实际应用变得较为困难。

点击化学反应的概念最早源自Sharpless，是指一些操作简单得就像敲击鼠标一样的化学反应，这些反应具有快速、高选择性、广泛适用性、对氧气与水不敏感、操作便捷、产物易纯化等众多优点，极大地简化了化合物的合成步骤[12-13]。其中，巯基-烯点击化学反应是制备各种原位交联水凝胶的理想方式[14-15]。Zhao等[16]将巯基化壳聚糖CS-NAc与双键化葡聚糖Dex-Ma通过巯基-烯点击化学反应交联形成CNDM 水凝胶，随着投料比与质量分数的改变，凝胶时间从12 min到12 h 不等。Ma 等[17]将CS 与PEG-DA 进行Michael 加成反应，制备得到的双键化壳聚糖PEGDA-CS具有光交联特性和良好的水溶性。但基于巯基-烯点击化学壳聚糖水凝胶相关的研究并不充分，无论是CS改性的实验操作，还是水凝胶的交联时间及可重复性等都有较大提高空间。

本研究参考了Dong等[18]的工作。采用甲磺酸(MSA)作为反应的溶剂与催化剂，将CS质子化，使得丙烯酰氯的取代发生在对位的羟基上，通过一步法就能得到接枝率很高的水溶性丙烯酰基壳聚糖(CS-AC)。之后首次将其应用于巯基-烯点击化学水凝胶的制备中，以带有端巯基的二硫苏糖醇(DTT)为交联剂，在紫外光(UV)光照下快速交联形成水凝胶。分析对比不同双键/巯基投料比水凝胶的凝胶时间、流变行为、溶胀率等性质。此外进行了细胞毒性实验及抗菌实验，探索水凝胶在载药抗菌材料方面的潜在应用。

2 实 验

2.1 原料

试验用原材料主要为壳聚糖(CS，DD=90%+)、甲磺酸(MSA)、丙烯酰氯、DL-二硫苏糖醇(DTT)、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯]-1-丙酮(I2959)、小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)。

2.2 丙烯酰基壳聚糖(CS-AC)的制备

称取2 g CS溶于15 m L MSA 中，在25～35℃下搅拌至完全溶解。使用恒温低温反应锅在0 ℃搅拌2 h后，缓慢滴入8 m L 丙烯酰氯，充分混合后继续在0 ℃搅拌6～8 h，使CS与丙烯酰氯充分反应。将反应液用500 m L 丙酮与乙醚的混合溶液(体积比1∶1)沉降，离心分离。得到的沉淀物用40 m L 甲醇溶解，之后用丙酮与乙醚的混合溶液进行再沉降。沉淀物用乙醚清洗2～3次，离心分离，在室温下抽真空干燥8～12 h 得到白色干燥粉末状产物CS-AC，置于冰箱保存。

由于丙烯酰氯十分不稳定，在高温或遇水情况下极易分解，故投入摩尔量为CS糖单元10倍左右的量进行反应，设计接枝度为100%，即每个糖单元上都接枝上一个双键。具体反应式如图1所示。

图1 CS-AC的合成反应式Fig.1 Synthesis route of CS-AC

2.3 巯基-烯点击化学水凝胶(CS-AC/DTT)的制备

首先称取6组0.1 g CS-AC分别溶于2 m L H2O中。之后每组分别加入10 mg光引发剂I2969，以及不同质量的DTT 配成不同双键/巯基投料比的前驱体溶液，置于玻璃培养皿中，用365 nm 的紫外光照射进行巯基-烯点击化学交联，并记录比较各组凝胶时间(溶液不流动，形成可以倒置的凝胶状)。重复上述实验5次，各组水凝胶凝胶时间取平均值。

UV 光照交联结束后，将水凝胶取出，置于MWCO=14 k Da的透析袋中进行透析操作，以除去未反应的I2959及DTT。透析24 h后，冷冻干燥。共成功制备得到对照组自交联水凝胶CS-CC-CS以及三组不同双键/巯基投料比的点击化学水凝胶CS-AC/DTT-0.25、CS-AC/DTT-0.5和CS-AC/DTT-1(其中0.25、0.5和1分别为各组水凝胶前驱体溶液中巯基与双键投料比理论值)。

图2 为CS-AC/DTT 点击化学水凝胶的合成示意图。

图2 CS-AC/DTT 水凝胶合成示意图Fig.2 Synthesis diagram of CS-AC/DTT hydrogel

2.4 表征与测试

使用Nicolet 6700型红外光谱仪对CS-AC 及CSAC/DTT进行FTIR测试，扫描波长为4000～500 cm-1，采用KBr压片法制备测试样品。

使用Bruker Avarice 400 型核磁共振波谱仪在400 MHz，室温下进行CS-AC 的1H-NMR 测试，样品溶于D2O 中。

使用MARS III旋转流变仪(Thermo)对四组水凝胶进行流变行为测试，采用变频扫描模式，频率变化从0.1～10 Hz，固定量应变1%，温度分别为25 ℃和37 ℃。

分别称取相同质量的四组冻干水凝胶CS-CCCS、CS-AC/DTT-0.25、CS-AC/DTT-0.5 和CS-AC/DTT-1，浸泡在p H=7.4的PBS缓冲液中。在25 ℃水浴锅中静置过夜，待其达到溶胀平衡后取出称重，利用式(1)计算四种水凝胶的溶胀率(Seq%)：

式中：Weq指的是溶胀平衡时凝胶的质量，Wd指的是样品冻干凝胶的质量。于37 ℃水浴锅中重复上述步骤对四组水凝胶样品进行溶胀性实验。

水凝胶的处理采用浸提液法。首先各称取8 mg四组冻干水凝胶，在DMEM 培养液中充分浸润后，各加入2 m L培养液，静置24 h后得到浸提液。用各组浸提液于96孔板中培养小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3(空白对照组与四组水凝胶浸提液，每组平行设5个孔，一共25个孔)24 h。对各孔细胞进行MTT 测试，使用酶标仪测定490 nm 下细胞孔板中的OD 值，按照式(2)计算cell viability：

其中：ODsample指的是样品组OD 值，ODcontrol为对照组OD 值。

采用物理负载的方式制备载有外用抗生素莫匹罗星(MUP)的水凝胶，用耐甲氧西林金葡萄球菌(MRSA)进行水凝胶的抗菌性测试。共设置了四组样品：不载药水凝胶CS-CC-CS、CS-AC/DTT 和载药水凝胶CS-CC-CS-MUP、CS-AC/DTT-MUP，分别记为a、b、c、d，每组设置3个平行实验。

每个琼脂培养基上涂布的细菌浓度为106cfu/mL的MRSA 悬液100μL。将各样品水凝胶用打孔器裁剪成相同大小(厚度3 mm，直径10 mm)的圆片，放置于各培养基中心位置。置于37 ℃恒温培养12 h后观察比较四组水凝胶周围的抑菌圈的大小并按式(3)进行计算：

其中：D2为抑菌圈外围总直径，D1为样品原始直径。

3 结果与讨论

3.1 丙烯酰基壳聚糖(CS-AC)的结构分析

图3分别为CS、CS-AC 以及CS-AC/DTT 的红外吸收光谱图。对比CS和CS-AC 可以看出，接枝产物CS-AC在1731及806、778 cm-1处的位置增加了C=O伸缩振动峰和碳碳双键中=CH 的面外弯曲振动峰，分别在1634和1412 cm-1处出现了明显的C=C伸缩振动峰和面内弯曲振动峰。这表明CS成功接枝了双键。对比CS-AC和CS-AC/DTT 可以看出，交联后的水凝胶样品的C=C 的吸收峰均有明显减少，由此可以说明在UV 照射下，CS-AC 与DTT 发生了巯基-烯点击化学反应，体系交联形成水凝胶。

图4 为CS-AC 的1H-NMR 谱图。可以看出在δ=6.5～6.0处有明显的CH2=CH-中三个质子的信号峰，进一步证明了CS-AC 中碳碳双键的成功接枝。同时根据谱图，通过式(4)计算出CS-AC的双键接枝度：

图3 CS-AC/DTT 的红外吸收光谱图Fig.3 FTIR spectra of CS-AC/DTT

其中：A 为信号峰的面积。计算得到CS-AC的双键接枝度大约为100%，即CS的每个糖单元上都接枝了一个双键。

图4 CS-AC的核磁共振氢谱Fig.4 1 H-NMR spectra of CS-AC

3.2 水凝胶性能分析

3.2.1 凝胶时间分析 共设计了六组不同双键/巯基投料比的水凝胶，表1为每组投料比和凝胶时间。分析交联现象发现，当巯基多于双键时，无法交联成凝胶。推测是由于体系中过量的巯基会发生副反应，阻碍巯基-烯点击化学反应的进行，破坏交联体系。其中，双键/巯基比为1∶0.5时交联速度最快，10 min以内就能完全交联成凝胶。双键/巯基比为1∶1时稍慢，可能是由于体系中实际的活性双键小于活性巯基导致过量巯基破坏交联体系。总体而言随着巯基投料量减少，交联时间变长，基本能在20 min内交联完全。而对照组自交联水凝胶CS-CC-CS需在40 min以上才能自交联形成凝胶，由此可以看出CS-AC/DTT 水凝胶能大大缩短CS水凝胶的交联时间。

表1 水凝胶配比及凝胶时间Table 1 Feed ratio and gelation time of hydrogels

3.2.2 水凝胶流变行为分析 图5(a)～(h)展示了25℃和37℃下各组水凝胶样品在变频扫描模式下的流变行为。从图可见，各组水凝胶的储能模量G'均大于损耗模量G″，展现出很好的凝胶特性。各组水凝胶的G'max在不同温度下都展现出类似的变化趋势，具体如表2 所示。对于CS-CC-CS、CS-AC/DTT-0.25和CS-AC/DTT-0.5，凝胶时间越短，水凝胶的G'max变小，这是由于体系快速交联成凝胶态时，仍有较多双键没有反应，交联点不够多，导致水凝胶强度不是很大。而对于CS-AC/DTT-1水凝胶，如之前分析的由于体系内交联网络被破坏，故呈现出的G'max大大减小。另外，随着测试温度升高，各组水凝胶的强度都有所提高。推测这是由于随着温度上升，水凝胶内的水分有所减少，同时残留的双键略有打开增加了交联点，使得整个凝胶的形态由原来的刚而脆逐渐变得增加了一定的韧性，使得凝胶强度增大。总体而言，除去巯基过量的CS-AC/DTT-1水凝胶，其它各组水凝胶都展现出5～10 k Pa左右的比较优异强度。

表2 水凝胶在25 ℃和37 ℃下的最大储能模量Table 2 G'max of hydrogels at 25 ℃and 37 ℃

3.2.3 水凝胶的溶胀性能分析 图6展示了四组冻干水凝胶分别在25 ℃和37 ℃下在p H=7.4 的PBS溶液中的溶胀率。从图可见，CS-AC/DTT-0.5水凝胶的溶胀率最大，在37 ℃下高达1415%。这是由于该组水凝胶具有最短的交联时间，体系中的交联点少，交联度低，因此体系可以吸收较多的水分。而CS-CC-CS自交联水凝胶由于具有较高的交联度，故溶胀率较低。另外，CS-AC/DTT-1 水凝胶由于体系中过量巯基破坏了部分交联网络，使得溶胀率有所下降。随着温度从25 ℃升至37 ℃，四组水凝胶的溶胀率都有一定的上升。

3.2.4 水凝胶的细胞毒性分析 图7为四组水凝胶样品浸提培养NIH-3T3 细胞的细胞存活率结果。从图可见，四组细胞存活率均大于90%，根据GB/T 14233.2-2005标准可以判断四组水凝胶材料的细胞毒性保持在1级，即材料对细胞增殖无明显抑制作用。其中，CS-CC-CS 自身就具有较好的细胞相容性，而CS-AC/DTT 中引入的巯基以及巯基-烯交联网络也未对材料的细胞相容性有影响。

图5 水凝胶流变行为：CS-CC-CS(a)25 ℃，(e)37 ℃；CS-VE/DTT-0.25(b)25 ℃，(f)37 ℃；CS-VE/DTT-0.5(c)25 ℃，(g)37 ℃；CS-VE/DTT-1(d)25 ℃，(h)37 ℃Fig.5 Hydrogel rheological behavior：CS-CC-CS (a)25 ℃，(e)37 ℃；CS-VE/DTT-0.25(b)25 ℃，(f)37 ℃；CS-VE/DTT-0.5(c)25 ℃，(g)37 ℃；CS-VE/DTT-1(d)25 ℃，(h)37 ℃

图6 水凝胶的溶胀率Fig.6 Swelling rate of hydrogels

图7 水凝胶的细胞毒性Fig.7 Cytotoxicity of hydrogels

3.2.5 水凝胶的抗菌性能分析 图8 为水凝胶的抗菌实验结果，抑菌圈宽度见表3。对比图8(a)和(b)可以看出，无论是CS-CC-CS还是CS-AC/DTT，未载药时就具有一定的抗菌性，这是由CS本身的抗菌性决定的，接枝双键以及与巯基交联都没有消除其抗菌性。对比不载药组图8(a)、(b)和载药组(c)、(d)可以看出，载有莫匹罗星的两组水凝胶表现出了十分明显的抗菌性，说明通过物理负载的方式，水凝胶成功负载了莫匹罗星并且能够通过扩散法产生抑菌效果。

图8 水凝胶的抑菌效果(a)CS-CC-CS；(b)CS-AC/DTT；(c)CS-CC-CS-MUP；(d)CS-AC/DTT-MUP(黑色圈表示样品水凝胶圆片原本大小，红色圈表示培养12 h后抑菌圈外围大小)Fig.8 Antibacterial effect of hydrogels (a)CS-CC-CS；(b)CS-AC/DTT；(c)CS-CC-CS-MUP；(d)CS-AC/DTT-MUP(black circle represents orginal size of hydrogel wafer sample，red circle represents size of inhibition zone after 12 h cultivation

表3 水凝胶的抑菌圈大小Table 3 Inhibition zone width of hydrogels

4 结 论

通过一步法可以将丙烯酰氯成功地接枝到CS上，合成带有双键侧基的可溶性丙烯酰基壳聚糖CSAC。通过1H-NMR 结果计算得到双键接枝率大约为100%，即每个糖单元上都带有一个碳碳双键。该改性操作为CS糖单元引入了新的反应位点，可供其进一步与其它官能化化合物进行交联反应。

CS-AC与DTT 在紫外光照射和I2959引发下进行巯基-烯点击化学反应，交联得到CS-AC/DTT 水凝胶。其最短在10 min之内就能凝胶完全，相较于自交联水凝胶CS-CC-CS大大缩短了凝胶时间。水凝胶具有5～10 k Pa左右的储能模量以及高达1415%的优异的溶胀率。各组水凝胶对小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3无明显细胞毒性。

通过物理法负载了莫匹罗星的水凝胶对于MRSA具有很好的扩散抑菌效果。表明该CS-AC/DTT 水凝胶在制备载药及抗菌材料方面具有潜在应用。