高盐稀态发酵法制作扇贝裙边海鲜酱油的工艺研究

秦 雨，张彩凤，辛梦茹，孙利芹 *，孙永军

（1.烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 264000；2.好当家集团有限公司，山东 威海 264200）

扇贝是我国重要的经济海产品之一，自20世纪70年代末随着海水养殖第三次浪潮的来临，扇贝的养殖量以及冻贝柱、干贝柱的加工和出口量越来越大，在海洋经济中占有重要地位。但是在扇贝柱加工过程中，大量扇贝裙边被弃于海边，只有小部分扇贝裙边作为虾饲料低价出售，在造成海洋污染的同时，也使得生物资源不能得到有效利用，造成资源的浪费[1-3]。海鲜酱油利用低值鱼、虾、贝类及扇贝裙边下脚料等为原料制作，口味鲜美，营养丰富，具备普通酱油没有的抗肿瘤、抗衰老等多种生理功能[4-5]。目前，日本和韩国等国家海鲜酿造酱油产品的品种和市场份额占比较多[6]，而在中国的调味品市场上，海鲜酱油品种较少。随着人民生活水平的提高以及对健康、时尚饮食的追求，传统酱油已经不能满足人们饮食方式多样性的需求，开发研究新型海鲜酱油有广阔市场前景。

发酵酱油的风味成分组成复杂，受原料、微生物、发酵工艺条件[7-10]的影响。传统酱油的发酵生产工艺通常有低盐固态发酵法和高盐稀态发酵法两种，前者由于在原料全氮利用率方面较低（通常仅为68%左右），故包括日本在内的国家通常采用高盐稀态发酵法，其平均全氮利用率可达83%左右[11]。我国传统酱油酿造经过多年的发展，工艺技术已处于领先水平，但关于海鲜酱油产品的开发和酿造工艺研究尚处于初级阶段，市面上的产品多是以酶解工艺获得的富含氨基酸的鲜味剂为主，全发酵型的海鲜酱油产品极少[12-13]。关于发酵工艺的研究多集中在菌种的筛选和酶解条件研究[14-15]，少数的研究集中在对发酵工艺技术的探讨，如丁琦等[16-18]研究采用低盐固态发酵法酿造扇贝裙边酱油和牡蛎酱油，但所建立的工艺存在氨基多糖、牛磺酸功能成分活性易被破坏，总酸含量高、酯化不充分[19]，影响口感等不足；许旖旎[20]采用吸附加包埋技术，将乳酸菌、酵母菌、红曲霉共同固定，建立混合细胞发酵固定化体系。在众多报道中，对高盐稀态发酵法酿造海鲜酱油的报道并不多，发酵工艺还有待深入研究。

鉴于上述背景，本研究充分利用黄渤海扇贝养殖与加工的优势，从废弃资源高值化利用的角度，在霉菌菌株优化筛选的基础上，进一步研究高盐稀态发酵法制作扇贝裙边海鲜酱油的工艺条件，以便为丰富我国高品质海鲜酱油市场，实现废弃资源的高值化利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

扇贝裙边（含水量55%～65%）：采集于烟台周边扇贝养殖企业；米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.042：烟台大学生物工程实验室保藏；黑曲霉（Aspergillus oryzae）As3.350：购自上海酿造研究所；某品牌海鲜酱油（高盐稀态发酵工艺酿造）：市售；福林酚试剂：上海荔达生物科技有限公司；L-酪氨酸：上海伊卡生物技术有限公司；乙酸：天津市永大化学试剂有限公司；苯酚、无水碳酸钠、葡萄糖：国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LDZX系列立式高压蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；UV-1200型紫外可见分光光度计：翱艺仪器有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱、HH-6数显恒温水浴锅、DHG-9140电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；2 L高盐稀态发酵罐：本实验室自制。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 制曲方法

表1 制曲初始原料配比Table 1 Initial proportion of raw materials for koji-making

豆粕或扇贝裙边（表1）加水（豆粕∶水=1∶1.5（g∶mL）），在60 ℃条件下润水40 min，自然pH，在121 ℃条件下于灭菌锅中蒸料20 min，趁热将结块的曲揺散，再加入粗麦粉，121℃灭菌20 min，趁热揺散。曲料中含水量约为30%～35%，曲料松散不成团。冷却后，分开接种米曲霉As3.042和黑曲霉As3.350，接种量为108个孢子/100 g。将曲均匀摇散后置于恒温培养箱中30 ℃培养并于曲面发白结块时翻曲，培养至实验设定的时间。

1.3.3 发酵工艺方法

按表2的成曲复配比例以及扇贝裙边添加量上罐装料，料液比=100∶250（g∶mL），盐水质量分数为18%，发酵前30 d温度为15 ℃，后150 d温度为30 ℃，发酵35 d左右（发酵液pH＜5.2）时加入酵母菌[21]，添加量为100～110 CFU/mL，定期取样检测。

1.3.4 测定方法

蛋白酶活力的测定采用福林酚法[22]：成曲糖化酶活力和淀粉酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[22]。

氨基酸态氮、总酸的测定：采用甲醛滴定法[22]；可溶性无盐固形物的测定：硝酸银滴定法[22]；总氮的测定：采用凯氏定氮法[22]；氨基多糖的测定：采用苯酚-硫酸法[22]；牛磺酸的测定：采用分光光度法[22]。

2 结果与分析

2.1 扇贝裙边添加比例和制曲时间的确定

分别以米曲霉As3.042和黑曲霉As3.350两种成曲产蛋白酶、糖化酶及淀粉酶的酶活力为指标，考察扇贝裙边添加量0、30%、50%、70%、100%对制曲的影响，以确定两种曲霉扇贝裙边的最优添加比例，结果如图1、图2所示。

由图1可知，3种胞外水解酶活力都随着培养时间的延长而增加，并在75 h以后趋于平稳。扇贝裙边添加量为50%时，米曲霉中中性蛋白酶的活力最高，在75 h时达到最大875 U/g，与不添加扇贝裙边的酶活力相当（905 U/g）；从糖化酶与淀粉酶活力看，扇贝裙边的添加比例越高，酶活力越高，均在添加比例100%时，二者酶活力最高，分别达到676 U/g和42 U/g，比0%添加时高出3.07和3.12倍。由于酱油制备中，需要强化蛋白的水解，因此蛋白酶活力是关键，且在制曲过程中发现，随着扇贝裙边添加量的增加，米曲孢子繁殖严重，有不良气味产生，不适宜上罐发酵。因此，综合考虑3种酶活力和菌丝生长状况，确定50%的扇贝裙边添加为最佳比例，即米曲霉As3.042菌种的制曲原料质量比为豆粕∶扇贝裙边∶粗麦粉∶水=25∶25∶33∶38，培养时长为75 h。

从图2可知，与米曲霉相似，扇贝裙边添加比例为50%时黑曲霉中酸性蛋白酶的酶活力最高，达到6 001 U/g，比0%添加时高出1.48倍；同时，扇贝裙边的添加有利于糖化酶和淀粉酶酶活力的提高，二者的最高值均出现在100%的添加组，酶活力分别达到4 594 U/g和77 U/g，比0%添加组高出2.45和1.53倍。但同样，制曲过程中发现扇贝裙边添加量过高，孢子繁殖严重，且产生不良气味。因此综合考虑，确定50%扇贝裙边添加比例为最佳，即黑曲霉As3.350制曲最佳原料配比为豆粕∶扇贝裙边∶粗麦粉∶水=25∶25∶33∶38，培养时长为69 h。

图2 不同扇贝裙边添加比例对黑曲霉AS3.350产酸性蛋白酶（A）、糖化酶（B）、淀粉酶（C）酶活力的影响Fig.2 Effect of different scallop skirt proportions on the activity of acid protease (A),saccharifying enzyme (B) and amylase (C) produced by Aspergillus niger AS3.350

2.2 高盐稀态发酵工艺条件优化

分别以氨基酸态氮、总氮、氨基多糖、牛磺酸、可溶性无机盐、总酸含量为评价指标，考察最佳成曲复配比例与发酵时间，结果如图3～图8所示。从发酵时间看，两种曲霉配比的酱油中氨基酸态氮、总氮、氨基多糖、牛磺酸的含量随着发酵时间的延长而提高，在发酵时间160 d时达到最大，随后指标开始下降，故高盐稀态的发酵时间确定为160 d。

从两种曲霉配比的数据分析看，米曲霉∶黑曲霉=1∶2时，两种霉更好地发挥协同作用，酱油中氨基酸态氮、总氮、氨基多糖、牛磺酸的含量明显高于米曲霉与黑曲霉复配比为1∶1时的产品指标，分别高出后者11.5%、10.1%、11.2%、11.6%。以氨基酸态氮为例，前者在发酵160 d时含量最高可达0.79 g/100 mL，比米曲霉∶黑曲霉=1∶1的添加比例组高出11.5%，二者在发酵前160 d，氨基酸态氮转化率很高，160 d后含量有下降趋势，酱醪中伴随酵母菌的生长繁殖，蛋白酶的最适作用条件发生改变，蛋白质水解速率变慢；詹春阳等[23]的研究曾指出，在米曲霉所产酶系当中偏酸性蛋白酶相对较少，而酱油发酵是在偏酸性环境中进行，在制曲过程中偏酸性蛋白酶酶活力越高，酱醪发酵成熟的越快，而黑曲霉具有很强的产酸性蛋白酶的能力，可以弥补米曲霉酶系酸性蛋白酶活力不高的缺陷，米曲霉∶黑曲霉=1∶2蛋白酶活力高，物料分解较完全；可溶性无机盐含量虽然后者更优，但两种添加比例组无显著差异，在160 d时二者均达到一级酱油标准；总酸含量随发酵时间的延长产生醇类物质而降低，已有文献报道指出[24]，酸类化合物是酯化反应的前提物质，乙酸乙酯是酱油中最常见的酯类物质，使香气挥发，风味提高，在发酵至160 d时，两种复配比例条件下酱油的总酸含量相当，均降至约2.5 g/100 mL。故而本研究综合考虑上述测定的酱油的品质指标，确定米曲霉∶黑曲霉=1∶2的接种比例为最佳复配比。

图3 米曲霉AS3.042及黑曲霉As3.350不同复配比例对氨基酸态氮含量的影响Fig.3 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger As3.350 proportions on ammonia nitrogen content

图4 米曲霉AS3.042及黑曲霉AS3.350不同复配比例对总氮含量的影响Fig.4 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger AS3.350 proportions on total nitrogen content

图5 米曲霉AS3.042及黑曲霉AS3.350不同复配比例对氨基多糖含量的影响Fig.5 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger AS3.350 proportions on aminopolysaccharide content

图6 米曲霉AS3.042及黑曲霉AS3.350不同复配比例对牛磺酸含量的影响Fig.6 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger AS3.350 proportions on taurine content

图7 米曲霉AS3.042及黑曲霉AS3.350不同复配比例对可溶性无盐固形物含量的影响Fig.7 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger AS3.350 proportions on soluble salt-free solid content

图8 米曲霉AS3.042及黑曲霉AS3.350不同复配比例对总酸含量的影响Fig.8 Effect of different Aspergillus oryzae AS3.042 and Aspergillus niger AS3.350 proportions on total acid content

2.3 海鲜酱油品质评价与对比分析

为进一步评价采用优化的高盐稀态发酵工艺制备的海鲜酱油的品质，将检测指标分别与国家标准和市售海鲜酱油的指标作对比分析，以便寻找差距与不足，便于后期工艺的进一步优化。

经高盐稀态发酵法酿造而成的海鲜酱油，色泽鲜艳呈红褐色，在发酵后期加入酵母菌，产生浓郁的酯香气味[24]，味道便鲜、咸，甜味适口，感官评价所制备的扇贝裙边高盐稀态发酵酱油均达到国标一级酱油的标准[25]。具体指标分析结果如表3所示。

表3 两种高盐稀态海鲜酱油指标检测结果Table 3 Determination results of indexes of two kinds of seafood soy sauce by high salt-dilut fermentation

由表3可知，与国标GB 18186—2000《酿造酱油》一级酱油相比，扇贝裙边海鲜酱油中的质量指标皆高于国家标准，其中总氮含量和氨基酸态氮含量分别为1.60 g/100 mL、0.79 g/100 mL，均高于国标要求；并且含有普通一级酱油所没有的牛磺酸、氨基多糖等功能性成分，在抗氧化、抗肿瘤等方面显示出很好的优势。与市售高端海鲜特级酱油相比，氨基酸态氮含量低38.7%，但牛磺酸和氨基多糖含量接近，分析原因，一方面与市售酱油作为成品酱油有后期调制的因素，另一方面也说明本工艺仍需在增加中性和酸性蛋白酶活性方面进一步改进、提高，不断优化。

3 结论

本研究从扇贝加工过程中的副产物扇贝裙边的高值化利用视角，以高品质海鲜酱油发酵制备为目标，在发酵用曲霉培养条件优化的基础上，在确定扇贝裙边取代豆粕的最佳添加比例为50%，米曲霉As3.042和黑曲霉As3.350的制曲配料为豆粕∶扇贝裙边∶粗麦粉∶水=25∶25∶33∶38（g∶g），培养时间分别为75 h和69 h的基础上，进一步优化了高盐稀态发酵工艺的工艺条件，确定了最佳的发酵时间为160 d，最佳的米曲与黑曲复配比例为1∶2，发酵温度前30 d为15 ℃，后150 d为30 ℃，其总氮和氨基酸态氮的含量为1.6 g/100 mL、0.79 g/100 mL，均高于国标要求，且含有普通一级酱油所没有的牛磺酸、氨基多糖等功能性成分，弥补传统酱油缺陷，在色香味、生理功能等方面显示出很好的优势。通过高盐稀态发酵法将低价值的扇贝裙边转化为营养价值高、海鲜风味浓郁的海鲜酱油，实现了低值资源的高值化利用，一定程度上对于丰富我国高端海鲜调味品市场有重要的意义，未来发展市场潜力可观。