长相思葡萄生长发育过程中理化指标及氨基酸含量分析

陈华伟，乐小凤，张振文，2*

（1.西北农林科技大学 葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100）

游离氨基酸是果实中的重要营养物质和相关风味物质的合成前体，对香蕉、苹果、番茄、草莓和甜瓜等果实的研究均表明相关氨基酸作为重要前体参与了支链酯类的合成[1-7]。一些氨基酸先通过转氨作用形成支链酮酸，然后经脱氢或脱羧形成酰基辅酶A和支链醇，再经过醇脱氢酶和醇酰基转移酶的催化进而形成支链酯类物质[8]。葡萄中的氨基酸占含氮化合物的25%～30%，在酿造葡萄酒过程中作为酵母的主要氮源，为葡萄酒的发酵香气（主要是酯类物质和高级醇）提供底物，也是微生物合成氨基甲酸乙酯和生物胺的前体物[9]，其含量的高低是发酵调控葡萄酒质量与安全的重要指标。半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸、亮氨酸和酪氨酸主要参与葡萄酒中高级醇的合成；参与葡萄酒中褚曲霉素A合成的是苯丙氨酸；鸟氨酸、精氨酸、色氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和丝氨酸分别对应合成葡萄酒中的腐胺、精胺、羟色胺、半胱胺、酪胺、组胺、苯乙胺、尸胺和乙醇胺[9-10]。氨基酸的生物合成途径各异，但共有的碳骨架主要来源于糖酵解、柠檬酸循环和戌糖磷酸等代谢途径的中间产物[11]。天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸在发酵时可优先被酿酒酵母所利用；缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸和异亮氨酸在葡萄酒酿造过程中可相应地转化为异丁醇、丙醇、异戊醇和活性戊醇，这些高级醇也可进一步形成高级醇醋酸酯，这些酯类和醇类物质是酒中主要的发酵香成分；脯氨酸是一种植物相容渗透剂，有利于抵御渗透胁迫[12-13]。酿酒酵母的氨基酸代谢对酒的风味品质有重要影响，产生的主要发酵香气物质包括支链酸、乙酸酯、高级醇、脂肪酸乙酯以及挥发性硫化物等[14]。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸作为前体物质可以通过莽草酸途径合成挥发性醚类、酚类以及酯类物质[15]。异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸可能是葡萄中重要的品种香气物质甲氧基吡嗪的合成底物，是酿酒葡萄果实中典型的青椒味香气特征化合物，很大程度上影响了葡萄酒的风味[16]。刘沛通等[17]的实验结果表明，添加支链氨基酸可以促进酵母细胞的生长和发酵速率，提高了酒中脂肪酸乙酯类物质含量，改善了葡萄酒的香气品质。GUTIÉRREZ A等[18]研究表明，外源添加精氨酸可促进酯类物质的合成。氨基酸浓度影响葡萄酒的香气品质，苏氨酸含量越高，酒中苯乙醇和异戊醇含量较高[19]。王亚钦[14]在模拟汁中添加支链氨基酸，结果发现酒中的乙酸苯乙酯、2-苯乙醇和脂肪酸的含量增加，添加较高浓度支链氨基酸更有利于葡萄酒香气物质积累。ITAY M等[20]研究发现，外源亮氨酸和苯丙氨酸促进了玫瑰香葡中醛类和醇类的合成，如3-甲基乙酸丁酯和2-苯乙酸含量显著增加。

由于果实中氨基酸与葡萄酒香气的密切关系，本试验从盛花期后40 d开始，对长相思葡萄果实发育过程中氨基酸成分的变化进行测定分析，以期了解这些组分在长相思葡萄生长发育过程中的变化规律，把握氨基酸组分形成的关键时期，为后期葡萄品质调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长相思葡萄（VitisviniferaSauvignon Blanc）自根苗：宁夏银川的张裕摩塞尔酒庄，定植于2011年，行距为2.0 m×2.8 m，斜拉“厂”字形单篱架，南北行向，进行常规田间管理。

盐酸、甲酸、碳酸钠、甲基纤维素、硫酸铵、十二水合磷酸氢二钠、甲醇、乙腈（均为分析纯）：美国Sigma-Aldrich公司；天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、氨基丁酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸和脯氨酸标准品（纯度均＞99%）：日本Shimadzu公司；葡萄糖、果糖、酒石酸、柠檬酸和苹果酸标准品（纯度均＞99%）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

PAL-1数字手持折糖仪：日本爱拓公司；AUW220D电子天平、LC-2030型岛津高效液相色谱仪、AJS-02色谱柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）：日本岛津公司；GL-20G-H 型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；LE438p H计：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计

2017年，葡萄浆果从盛花期后40 d开始采集，约每10天采一次样，直至成熟（花后105 d），共采样7次。每次上午10点随机采集样品约800粒，生物学重复3次，液氮速冻后置于-40 ℃冰箱。

1.3.2 基本理化指标的测定

随机选取100粒果实用于测定百粒质量、可溶性固形物、可滴定酸含量和pH值，均重复3次。百粒质量采用分析天平进行称量；可溶性固形物、可滴定酸含量和pH值分别用手持糖度计、NaOH滴定法和pH计测定[21]；同时随机选取150粒用于长相思葡萄果皮中总酚和单宁含量的测定[22]。

1.3.3 果实氨基酸的测定

氨基酸的测定：参考YUE X F等[23]的方法。每个处理随机取100粒果实，在液氮环境下去籽后磨粉，将粉末收集于50 mL离心管中，4 ℃浸渍4 h后在4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min，用0.45 μm的尼龙膜过滤葡萄汁，取100 μL过滤后的葡萄汁与50 μL内标液、400 μL 0.1 mol/L HCl混合。分离柱为AJS-02（4.6 mm×150 mm，3 μm）色谱柱，柱温45 ℃。洗脱液A：2 000 mL盐酸缓冲液（pH 8.2），9.0 g磷酸氢二钠十二水合物和9.5 g四硼酸钠十水合物；洗脱液B：水，乙腈和甲醇（10∶45∶45，V/V）。氨基酸的定性和定量参照OLIVA J等[24]的方法，主要根据外标和保留时间进行的，每样品重复测定3次，取平均值。

1.3.4 数据分析

试验数据采用SPSS19.0软件进行统计分析，使用Duncan’s差异显著性分析，显著水平P＜0.05。用Excel 2016软件制作图表。

2 结果与分析

2.1 长相思葡萄生长发育过程中基本理化指标的变化

长相思葡萄生长发育过程中可溶性固形物、可滴定酸含量、pH值、百粒质量、总酚和单宁的变化趋势见表1。由表1可知，葡萄浆果的可溶性固形物在花后40～50 d缓慢增长，花后50～60 d急剧增长，花后60～105 d增长缓慢；从花后40 d到成熟，葡萄浆果的可溶性固形物由5.05°Bx增长至22.25°Bx。可滴定酸含量在花后40～50 d缓慢下降，花后50～70 d迅速下降，花后70～105 d下降缓慢；可滴定酸含量由35.69 g/L下降至6.25 g/L。果实pH值呈缓慢上升的趋势，和可滴定酸含量下降的趋势基本相同，由2.71上升至3.94。葡萄浆果百粒质量的变化趋势与可溶性固形物含量变化趋势一致，花后40～105 d，葡萄浆果的百粒质量由83.77 g增长至204.88 g。葡萄浆果发育过程中总酚含量从花后40～90 d呈下降趋势，成熟时含量趋于稳定；从花后40 d到成熟，总酚含量由41.68 mg/g 下降至14.53 mg/g。浆果的单宁含量在花后40～60 d迅速下降，花后60～70 d含量略微回升，花后70～105 d含量持续下降；从花后40 d到成熟，单宁含量由28.87 mg/g下降至1.38 mg/g。

表1 长相思葡萄生长发育过程中基本理化指标的变化Table 1 Changes of basic physical and chemical indicators during the growth and development process of Sauvignon Blanc

2.2 长相思葡萄生长发育过程中氨基酸含量的变化

长相思葡萄生长发育过程中的氨基酸含量变化见表2。由表2可知，共检测到16种氨基酸。16种氨基酸在长相思葡萄生长发育过程中主要呈4种变化趋势：胱氨酸从花后40 d到花后90 d呈缓慢下降趋势，在成熟时增长至130.52 mg/L。亮氨酸是葡萄酒发酵香气物质的主要底物，其在葡萄中的含量对酒中高级醇、酸及相应酯类物质的合成具有重要影响。其在葡萄浆果生长发育过程中呈增长趋势，从花后40 d的67.77 mg/L增长至花后105 d的336.75 mg/L。甲硫氨酸、苏氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的含量在发育过程中变化不大，保持相对稳定；其余9种氨基酸的含量从花后40 d到花后90 d呈增长趋势，成熟时含量下降。精氨酸通常是葡萄果实中含量最高的氨基酸，也是葡萄中氮的主要储存形式，前人研究表明精氨酸在赤霞珠葡萄果实转色期时大量积累，在成熟前有小幅度的降低；脯氨酸是一种植物相容渗透剂，可以提高酿酒酵母细胞对乙醇的耐受性，脯氨酸含量也比较高但不能被酿酒酵母同化吸收，所以精氨酸与脯氨酸含量的比例通常用来衡量葡萄的可同化氮状况，比值越高则酵母可利用氮源比例越高[25]。精氨酸与脯氨酸含量比值的变化情况可知，精氨酸与脯氨酸含量的比值从花后50 d快速增加，成熟时达到最大值（5.67），表明长相思葡萄中的酵母可利用氮源是随着生长发育而逐渐积累的，在采收时最多。

表2 长相思葡萄生长发育过程中氨基酸含量的变化Table 2 Changes of amino acid contents during the growth and development process of Sauvignon Blanc

2.3 长相思葡萄生长发育过程中营养成分的主成分分析

用SPSS 19.0对长相思葡萄的可溶性固形物、可滴定酸、pH、百粒质量、总酚、单宁以及16种氨基酸的含量进行主成分分析。由图1、图2可知，第1主成分方差贡献率为79.725%，第2主成分方差贡献率为14.792%，累计方差贡献率为94.518%。不同发育时期的长相思葡萄分布比较分散，花后40 d、50 d和60 d的葡萄分布在第一主成分的负方向，葡萄中总酚、单宁、可滴定酸、苹果酸、胱氨酸和甲硫氨酸含量较高；花后70 d、80 d和90 d的葡萄分布在第一主成分和第二主成分的正方向，花后80 d和90 d的葡萄中可溶性固形物、pH、葡萄糖、果糖、γ-氨基丁酸、甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸和组氨酸等含量较高；成熟时的葡萄主要分布在第一主成分的正方向和第二主成分的负方向，葡萄中苏氨酸和亮氨酸的含量达到最大值。

图1 不同生长发育期与果实品质相关物质的主成分分析结果Fig.1 Principal components analysis results of substances related to grape quality at different growth and developmental stages

图2 长相思葡萄生长发育过程中营养成分的第1、2主成分得分散点图Fig.2 Scatter plot of nutritional components during the growth and development process of Sauvignon Blanc based on the first and second principal component scores

3 讨论

葡萄果实的糖主要储存在果肉中，是影响葡萄品质的重要因素，随着果实的成熟大量积累，葡萄光合作用合成的蔗糖从叶片经韧皮部运输到葡萄浆果，转化为含量相当的果糖和葡萄糖，蔗糖含量则较低[21]。葡萄果实中糖分合成与积累主要受蔗糖合成酶、转化酶和蔗糖磷酸合成酶等相关酶的调控[22]。本试验结果表明，随着长相思葡萄果实的成熟，可溶性固形物含量成上升趋势，这与前人研究结果一致[26-27]。酿酒葡萄中的可滴定酸不仅影响葡萄的成熟度和最终品质，葡萄中的pH值也在一定程度上影响葡萄酒的微生物稳定性，不同葡萄品种中的可滴定酸含量各异[28]。实验结果发现，长相思葡萄中的可滴定酸含量逐渐下降，与成冰等[28-29]的研究结果一致。相关研究表明酸含量在葡萄浆果成熟过程中下降可能是由于浆果中酸的合成受到抑制，也有可能是呼吸作用的消耗转化成其他物质，葡萄中的有机酸也可以与钾盐作用[30]；张雪等[31]认为是由于葡萄浆果体积的增加从而产生的稀释作用。酿酒葡萄果实中总酚和单宁主要存在于果皮和种子中，对葡萄的抗氧化性起着非常大的作用，酚类物质的合成与积累受外界环境因素和栽培管理措施等影响[32]。本试验结果表明总酚在发育早期含量较高，随着葡萄生长发育含量逐渐下降，成熟时含量趋于平稳，单宁含量成熟时比较低，与李杨昕等[33]在玫瑰香葡萄上实验结果一致。

氨基酸是葡萄中重要的含氮化合物，主要分布在果皮和果肉中，在酿酒过程中为酿酒酵母提供动力，也是葡萄中某些香气的前体物质，氨基酸浓度和组成会受葡萄品种、成熟度、砧木和气候等条件影响[22，34]。不同产区、不同品种和不同栽培模式下葡萄果实的氨基酸的积累规律不同。本实验结果表明绝大大部分的氨基酸组分的含量都随着葡萄的生长发育而增加，这与BELL S J等[34]研究结果一致。精氨酸是葡萄氨基酸中含量最高的，其次是脯氨酸和亮氨酸。前人研究表明[34]精氨酸在赤霞珠葡萄果实转色期时大量积累，在成熟前有小幅度的降低，和本实验研究结果一致。长相思于花后60 d开始变软，精氨酸含量从187.43 mg/L快速合成至469.52 mg/L，之后含量一直上升，于花后90 d达到最大值（981.19 mg/L），成熟时则小幅度下降为870.09 mg/L。精氨酸是氮的主要储存形式，接近成熟期的浆果精氨酸浓度的降低可能是向贮藏器官迁移为下一年的营养做准备，精氨酸也会向脯氨酸转化，脯氨酸也在成熟前达到最大值，成熟时含量略有下降，与前人在赤霞珠葡萄中研究结果类似[34]。亮氨酸是葡萄果实甲氧基吡嗪等的前体物，也是酵母代谢产生高级醇和酸的重要前体物。亮氨酸在长相思葡萄发育过程中一直呈上升趋势，花后50 d开始快速积累，成熟时达到最大值（336.75 mg/L），表明成熟的葡萄可以提供含量较多香气前体物质，该类氨基酸的积累规律也与葡萄中相关的香气积累一致[14]。

4 结论

本试验对长相思葡萄生长发育过程中葡萄浆果生长发育7个时期葡萄的基本理化指标氨基酸组分进行测定，并对果实品质进行主成分分析。结果表明，可溶性固形物含量和百粒质量、pH值随着长相思葡萄果实的发育呈上升趋势；可滴定酸、总酚和单宁含量呈下降趋势。从葡萄浆果共检测出16种氨基酸组分，其中胱氨酸从花后40 d到花后90 d呈缓慢下降趋势，在成熟时（花后105 d）增长至130.52 mg/L；甲硫氨酸、苏氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和赖氨酸含量在发育过程中保持相对稳定，亮氨酸则从花后40 d的67.77 mg/L持续增长至成熟时的336.75 mg/L，其他9种氨基酸的含量从花后40 d到花后90 d呈增长趋势，在成熟前略有下降。精氨酸与脯氨酸含量的比值从花后50 d快速增加，成熟时达到最大值（5.67）。表明长相思葡萄在不同发育时期的氨基酸含量差异较大。本试验分析氨基酸组分形成的关键时期，为后期葡萄品质调控提供理论依据。