风味物质4-乙烯基愈创木酚的研究进展

李青卓，王嘉瑞，张小龙，付彩霞，汪 超，徐 宁，吕文平*

（1.湖北工业大学 生物工程与食品学院 湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 443000；2.湖北土老憨生态农业科技股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

近年来，随着天然产品的流行，使得人们对香气成分的兴趣日益增加，4-乙烯基衍生物被监管机构批准为调味剂[2]和肉类产品的保存剂。除了具有作为香料和添加剂的商业价值外，4-乙烯基愈创木酚由于其抗氧化活性和抗癌活性[3]，在医药制品领域，如用于眼科领域，作为隐形眼镜溶液和滴眼剂[4]也存在潜在的药用价值。近年来，全球市场对天然芳香化合物的需求逐步增长，所以，寻找安全高效的天然4-乙烯基愈创木酚的生物合成途径是很有必要的。

1 4-乙烯基愈创木酚的结构及其理化性质

4-乙烯基愈创木酚为乙烯基酚衍生物，一种吡喃花青素，是包括香草醛在内的一组芳香族单体酚成员，在食品工业中被广泛用作调味剂。其分子式为C9H10O2，密度1.11×103kg/m3，熔点26～29 ℃，沸点100 ℃/667 Pa。天然4-乙烯基愈创木酚主要存在于玉米酒精发酵的挥发物中，为无色或淡黄色油状液体，有发酵气息、微带甜味和独特的酚感，不溶于水，但溶于甲醇和油类。4-乙基烯愈创木酚的分子结构如下：

4-乙烯基愈创木酚的分析检测方法数量有限，该领域早期工作主要采用气相色谱法，但是此方法较为复杂且耗时较长。近年来，人们对高效液相色谱法使用较为普遍，MADIGAN D等[5]确定了一种高效液相色谱法测定麦汁、啤酒中的4-乙烯基愈创木酚的含量，该方法简单快速，结果准确，精密度高，其次还有顶空固相微萃取-气质联用、荧光检测等方法[6]。

2 4-乙烯基愈创木酚的生物合成

目前，市场上的4-乙烯基愈创木酚多采用化学法合成，需要较多的前体物质。有些还需要较为剧烈的条件，如高温高压，微波加热诱导脱羧等[7]。但化学合成法生产出的产品都不属于天然物质。由于4-乙烯基愈创木酚很大一部分用于香精、医药及食品工业，而化学合成品用于这些行业有很大的不安全性。所以，寻找快速安全生产4-乙烯基愈创木酚的生物合成途径是很有必要的。现有研究报道4-乙烯基愈创木酚的生物合成法有微生物发酵法、植物细胞培养法和酶法。

2.1 微生物发酵法

微生物发酵法是指微生物在适宜的条件下，对底物进行分解和利用从而转化为人类所需产物的过程，它的优点是避免使用重金属，有机溶剂以及强酸和强碱，因此合成过程对环境友好，并且因其生产成本较低，所以微生物发酵法成为近年来生产4-乙烯基愈创木酚的研究趋势。已有研究表明，多种细菌和真菌能够将阿魏酸脱羧转化为4-乙烯基愈创木酚[8]。

MISHRA S等[9]综述了微生物催化阿魏酸转化为4-乙烯基愈创木酚的7种不同代谢途径。具体途径如下：

以上代谢途径表明了阿魏酸生物转化为4-乙烯基愈创木酚的过程中微生物以及其他高附加值化合物呈现多样性。在途径1中[10]，阿魏酸经醌型中间体物质转化为4-乙烯基愈创木酚，并进一步转化成另一种醌型中间体从而形成1-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-乙醇和香草酮。另外，4-乙烯基愈创木酚也可以转化为4-乙基愈创木酚、香草醛、香草酸和原儿茶酸。

在途径2中提出了阿魏酸可以利用肠杆菌（Enterobacter soli）形成4-乙烯基愈创木酚，此外也产生了少量的香草醛、香兰醇和香草酸[11]。在途径3中，链霉菌（Streptomyces setonii）ATCC 39116在测试培养基中对阿魏酸进行生物转化后产生了4-乙烯基愈创木酚（物质的量产率为111%）、香草醛、香草酸、香草醇和原儿茶酸[12]。在途径4中，凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）BK07可在7 h内将阿魏酸催化为4-乙烯基愈创木酚，与途径3相比，此途径的不同之处在于香草醛未氧化为香草醇[13]。在途径5中，黑曲霉（Aspergillus niger）DAR2的二倍体菌株与途径4中凝结芽孢杆菌BK07降解阿魏酸的途径相同，但是将其再培养120 h后香草醛会被氧化成香草酮和香草醇[14]。在途径6中，费氏乳杆菌（Lactobacillus farciminis）将阿魏酸转化为4-乙烯基愈创木酚作为唯一的代谢产物，摩尔产率为26.50%。然而，在途径7中，白腐真菌在24 h内将阿魏酸降解为4-乙烯基愈创木酚作为主要的代谢产物，将其进一步培养24 h则会导致少量香草醛、香草酮和香草酸的产生[15]。

例如，在学习关于重量的内容时，我就带了两袋食盐和一袋洗衣粉，另外还有硬币，其中食盐的袋子上标注着500克，洗衣粉的袋子上标注着1000克，而硬币上面没有标注。通过观察实物，学生就能够对重量有一个大概的认识，并且对重量单位也有了基本的了解。又如，在教学“周长”相关内容时，我让学生量一量黑板、课桌、书本的长和宽，然后计算，甚至可以在父母的帮助下量一量自己家里家具面的长和宽。

2.2 植物细胞培养法

许多天然香料成分主要来源于植物，植物细胞培养是一种使植物细胞在培养液中合成代谢产物从而获取天然香气化合物的技术。植物是许多天然香料成分的主要来源，植物细胞培养技术是随着生物技术的发展而发展起来的一种使植物细胞在培养液中合成代谢产物的技术。

植物细胞培养法可以通过阿魏酸的生物催化脱羧反应而合成多种天然芳香化合物，如4-乙烯基愈创木酚、3-硝基苯乙烯和呋喃。TAKEMOTO M等[16]利用悬浮培养的细胞制备4-乙烯基愈创木酚，这些细胞是从烟草、胡萝卜、野茶树和长春花中分离出来的，当底物反式阿魏酸加入细胞悬浮液中进行植物细胞培养时，可以定量产出4-乙烯基愈创木酚，其中4-乙烯基愈创木酚在长春花发酵液中的转化率为65%，烟草为50%，胡萝卜为30%；在以野茶树为原料的发酵液中底物反式阿魏酸无法生物脱羧为4-乙烯基愈创木酚。

细胞悬浮培养有培养条件不易控制、细胞位置不固定、难以形成愈伤组织和极易发生污染等缺点[17]，所以目标产物4-乙烯基愈创木酚的产量不高，这可通过细胞固定化培养加以改善，提高4-乙烯基愈创木酚产量。

2.3 酶法

所有的生物代谢反应都是酶促反应。尽管上述几种方法的作用机理尚不完全清晰，但可以确定它们都是由一种或几种酶引起的。如能分离得到这些酶，利用酶促反应，则可更直接高效地生产4-乙烯基愈创木酚。目前国内外的研究状况如表1所示。

酶促反应制备天然香气化合物最重要的优点是，副产物较少，底物的可选择性高，反应条件简单温和，从而可以一步生成对应体化合物。但在一定程度上，利用酶法生产4-乙烯基愈创木酚容易受到底物浓度、酶活性和稳定性的影响，所以如何优化底物浓度以及利用生物手段和酶学知识对酚酸脱羧酶进行纯化、定向改造，研究其改造固定化技术从而增加酶的稳定性，是人们运用酶法生产4-乙烯基愈创木酚将要面临的主要工作。

表1 酶法生产4-乙烯基愈创木酚的国内外研究情况Table 1 Research progress of enzymatic production of 4-vinylguaiacol at home and abroad

3 发酵食品中4-乙烯基愈创木酚的作用

3.1 白酒

白酒的香味化合物十分复杂，种类繁多，其中挥发性酚类化合物是白酒中的重要香味组成部分，对于白酒的香气、口感及稳定性等方面均有着重要的作用[23]。4-乙烯基愈创木酚在白酒中的含量极少，但呈香作用却很强，仅几千分之一就能使人感觉到其特有的香气。4-乙烯基愈创木酚是白酒中常见的呈香和呈味化合物，且风味活性较高。其香味阈值为209.30 μg/L[24]，对白酒整体贡献水果香、花香和甜香。

崔利[25]在研究形成酱香型白酒风格属性的关键工艺时，发现在高温制曲的过程中，阿魏酸与植物细胞壁相连接的酯键断裂从而释放阿魏酸，在曲霉、酵母等微生物的作用下生成4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、香草醛和香草酸等酚类化合物，其中4-乙基愈创木酚和4-乙烯基愈创木酚赋予酱香型白酒特有的甜香、花香和烟熏风味。柳军[26]研究表明，在口子窖酒中，4-乙烯基愈创木酚具有最大的香气强度值（Intensity＞3.50），呈中药气味，其次是4-乙基愈创木酚和香草醛（Intensity＞3.00）。由香气强度值可知，4-乙烯基愈创木酚和香兰素对口子窖酒整体香气贡献较大，主要赋予口子窖酒药香与甜香，使其醇香宜人。杨玉波等[27]对茅台酒的香气成分进行了分析，并结合风味成分气味活性值（odor activity values，OAV）值分析发现苯乙醛、4-乙烯基愈创木酚和愈创木酚3 种化合物的OAV值均＞1，从而明确4-乙烯基愈创木酚是焦糖香的关键化合物，苯乙醛主要贡献了甜香和花香特征。

3.2 啤酒

在啤酒生产过程中，小麦麦壳中的阿魏酸进行酶促或热分解产生4-乙烯基愈创木酚，虽然啤酒中4-乙烯基愈创木酚感官阈值很低仅为0.3 mg/L，但它的存在可以赋予啤酒辛辣、烟熏和丁香般的风味[28]。在大多数下面发酵啤酒中，4-乙烯基愈创木酚的风味被认为是不可取的，因而被称为是酚类异味，所以这些啤酒中4-乙烯基愈创木酚的存在可作为啤酒厂中野生酵母或细菌污染的指标。尽管它在下面发酵啤酒中是异味物质，但4-乙烯基愈创木酚却是形成比利时啤酒、德国维岑啤酒和劳赫啤酒等上面发酵啤酒香气的必需成分。

COGHE S等[29]研究上面发酵啤酒时指出，酚类化合物是构成上面发酵小麦啤酒特有风味属性的重要物质，而其中的4-乙烯基愈创木酚（4-vinylguaiacol，4VG）和4-乙烯基苯酚（4-vinylphenol，4VP）起着关键作用，它们分别具有木质香和刺激的酸味。上述两种风味物质存在于酿造麦芽中，经过制麦和糖化等工序进入啤酒中。其中4VG 是影响成品酒香气形成的关键组分，4VP 是成品酒风味中不可缺少的组分。根据成东东[30]的实验数据表明，比利时和德国小麦啤酒中都含有相对较高的4VG和4VP，其中，比利时小麦啤酒中4VG、4VP含量分别为3.251 mg/L和1.268 mg/L，德国小麦啤酒中4VG、4VP含量分别为3.690 mg/L和1.572 mg/L，这与在成品小麦啤酒的感官品评中德国小麦啤酒的酚香味稍浓于比利时小麦啤酒的结果是吻合的。

3.3 葡萄酒

随着葡萄酒化学学科的形成和发展，葡萄酒品质的分析集中在其香气和风味物质上，葡萄酒的香气质量是影响葡萄酒品质和消费者购买意向的主要因素。在葡萄酒的感官方面，羟基肉桂酸对葡萄酒的风味影响不大，但其衍生物如4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈创木酚对葡萄酒的风味产生有很大的影响[31]。这些挥发性酚的感官阈值较低，对葡萄酒的风味形成具有促进作用。但是超过一定浓度（极限阈值=725 μg/L乙烯基苯酚混合物，即4-乙烯基愈创木酚∶4-乙烯基苯酚=1∶1），可使葡萄酒带有动物皮革、马厩或马汗的味道，严重影响酒的风味[32]。RAPP A[33]研究认为，当乙烯基苯酚混合物的阈值＞800 μg/L时，葡萄酒会出现塑料和绷带等异嗅。

研究发现，羟基肉桂酸通过羟基苯乙烯脱羧酶转化为其乙烯衍生物，然后经还原酶还原为乙基衍生物[34]，前人研究报道酿酒酵母可以通过非氧化脱羧作用将葡萄酒中的对香豆酸和阿魏酸转化为相应的乙烯基酚，其中葡萄酒内4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈木创酚的含量为0～2.8 g/L[35]。因此，对于酿酒师来说，控制葡萄酒中这些挥发性酚类化合物的浓度非常重要。

3.4 酱油

酱油是一种传统的发酵调味品，香气是酱油风味的重要品质特征，许多研究表明酚类物质是酱油酱香味的主要来源，虽然它们的含量不高，但具有相对较高的气味活度值，因此对酱油的风味特性（如浓郁的酱香香气）具有决定性作用[36]。酱油原料中的木质素经米曲霉作用断裂酯键释放出阿魏酸，然后在酵母菌的作用下形成酚类物质，其中在酱油中具有代表性的酚类成分是4-乙烯基愈创木酚和4-乙基愈创木酚，它们的香气特征十分强烈且活性明显，赋予酱油丁香香味和烟熏的香气，于整体风味感管至关重要。酱油中含有微量的4VG和4-EG就可以明显提高酱油的风味[37]。

刘巍等[38]利用同时蒸馏萃取和固相微萃取技术分析酱油中挥发性组分时发现，对酱油香气成分贡献最大的是4-乙烯基愈创木酚、4-羟基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）呋喃酮（4-hydroxy-2（5）-ethyl-5（2）-methyl-3（2H）furanone，HEMF）、乙醇、2,3-丁二醇以及3-甲硫基丙醇。并且指出4-乙烯基愈创木酚具有特征的酱香和烟熏香，且香气活性强，对酱油风味贡献较大，而使得风味更加丰满，是提高香气特征的关键，同时它也具有中和调节酱油中盐分的呈味作用。李杨等[39]对酱油的香气成分进行了分析，并结合OAV值确定了酱油中主要的香气物质为4-乙烯基愈创木酚、1-辛烯-3-醇、苯乙醛和乙酸。其中4-乙烯基愈创木酚在所有酱油样品中均检出，并且含量相对较高，平均香气活性值达到3.4，能为酱油贡献烟熏香气。

4 展望

随着4-乙烯基愈创木酚应用范围的逐步扩大，其市场价值、产品性质和合成方法越来越受到人们的关注。利用生物合成法制备4-乙烯基愈创木酚是一项新兴的技术，以其成本低、污染小、天然性和安全性高等优点越来越广泛的应用于食品行业，虽然生物合成法生产天然4-乙烯基愈创木酚正处在初步的探索阶段，但是无疑具有广阔的发展前景。

目前4-乙烯基愈创木酚的生物合成法研究已经取得一些实质性进步，但要真正实现工业化生产，逐步提高4-乙烯基愈创木酚等风味物质的含量，以全面提升白酒、啤酒、葡萄酒和酱油等传统发酵食品的质量，还需进一步解决如下问题：阐明4-乙烯基愈创木酚的形成途径及代谢机理，筛选出产4-乙烯基愈创木酚较高的微生物，植物细胞培养技术、酶分离提纯技术以及生物合成方法的建立与完善。