妊娠中期胎儿7 446例羊水染色体核型结果分析*

范美荣，随瑞枝，宋旭梅

(宁夏医科大学总医院医学实验中心，宁夏 银川 750000)

染色体病是由染色体数目异常或结构异常导致的疾病，是导致新生儿出生缺陷中最常见的遗传性疾病，我国染色体病患儿占新生儿的0.5%～0.1%，主要特征为生长发育迟缓、智力低下和多器官畸形等。目前尚无有效治疗方法，给社会和家庭造成了沉重的经济及精神负担，仅可通过产前诊断预防此类患儿的出生。羊膜腔穿刺及羊水染色体核型分析是最常用且安全、可靠的侵入性产前诊断技术，是胎儿染色体疾病诊断的“金标准”。本研究对7 446例妊娠中期胎儿羊水染色体核型结果及产前诊断高风险指征进行了回顾性分析，以期为临床遗传咨询工作提供科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2010年1月至2019年12月本院产前诊断中心收治的进行遗传咨询并进行羊水穿刺孕妇7 446例，年龄18～47岁，孕周15～27周。诊断指征包括血清学筛查高/临界风险、年龄高风险(生育年龄大于或等于35岁)、超声检测异常、夫妇一方染色体异常、无创基因检测高风险、不良孕产史等。术前与孕妇及家属签署知情同意书，并充分告知羊膜腔穿刺的注意事项和临床意义。

1.2方法 按传统制备方法，医生在超声引导下经腹部行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL，分装在2个无菌离心管中，离心去上清液后分别接种至2个含有羊水培养基的培养瓶内，然后置于37 ℃二氧化碳培养箱中培养至7～10 d，当贴壁羊水细胞生长旺盛时于低倍镜下观察有3～5个大集落或6～8个中小集落时进行换液。再继续培养1～2 d，待贴壁细胞几乎平铺整个培养瓶时加20 μg/mL秋水仙素50 μL，将羊水细胞阻留至中期分裂相。继续培养4 h后收获羊水细胞，经消化、低渗、预固定、固定、制片、显带等步骤后进行染色体核型分析。每例羊水标本两线培养物共计数20个分裂相，至少分析5个核型，异常核型加大计数和核型分析，核型按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2016)》命名。对部分多态性变异加做N显带及C显带检测，以明确其性质。本研究未将染色体多态纳入异常染色体范畴。7 446例羊水培养中有2例为严重血性标本，均只有一线成功培养并制备出染色体，最终用一线羊水培养结果发放报告并告知临床及孕妇。

2 结 果

2.1羊水染色体核型分析结果 7 446例孕妇中检出异常核型665例，异常检出率为8.9%。

2.2异常染色体核型分布情况 665例异常染色体核型中检出非整倍体异常核型419例(63.0%)，其中21-三体(包括罗氏易位型21-三体)231例(34.7%)，18-三体52例(7.8%)，13-三体4例(0.6%)，性染色体86例(13.0%)，额外微小标记染色体6例(0.9%)，非整倍体异常核型与正常核型组成的嵌合体40例(6.0%)，性染色非整倍体异常中包括47，XXY(Klinefelter 综合征)35例，47，XXX(XXX综合征)23例，47，XYY(XYY综合征)9例，45，X(Turner 综合征)19例。665例异常染色体核型中检出染色体结构异常246例(37.0%)，其中平衡性结构异常包括平衡易位62例(9.3%)，罗伯逊易位21例(3.2%)，倒位28例(4.2%)，插入3例(0.4%)；非平衡性结构异常包括衍生染色体39例(5.9%)，增加7例(1.0%)，缺失10例(1.5%)，环形染色体7例(1.1%)，假双着丝粒染色体21例(3.2%)，等臂染色体16例(2.4%)，结构异常染色体与正常核型组成的嵌合体32例(4.8%)。见表1。

表1 异常染色体核型分布情况(n=665)

2.3不同产前诊断指征的异常核型发生率比较 7 446例孕妇产前诊断指征构成比由高至低依次为血清学筛查高/临界风险、年龄高风险(生育年龄大于或等于35岁)、超声检测异常、夫妇一方染色体异常、无创产前基因检测(NIPT)高风险、不良孕产史、年龄高风险合并其他指征、其他指征(包括孕早期不良接触史、用药史、羊水过多/过少、患者要求等)。665例异常染色体核型中异常检出率由高至低的产前诊断指征依次为NIPT高风险、夫妇一方染色体异常、年龄高风险(生育年龄大于或等于35岁)、超声检测异常、年龄高风险合并其他指征、血清学筛查高/临界风险、不良孕产史、其他指征。见表2。

表2 不同产前诊断指征的异常核型发生率比较

3 讨 论

我国是出生缺陷的高发国家，根据《中国出生缺陷防治报告(2012)》的统计，我国出生缺陷发生率与世界中等收入国家的平均水平接近(5.6%)，每年新增加出生缺陷数为90万例，其中出生时明显可见的出生缺陷有25万例。出生缺陷不但是造成儿童残疾的重要原因，也日渐成为儿童死亡的主要原因，在全国婴儿死因中的比例高达19.1%[1]。通过羊膜腔穿刺抽取孕中期羊水标本进行羊水细胞培养及染色体核型分析是最常见且安全、可靠的侵入性产前诊断技术，也是降低围产儿死亡、预防异常胎儿的出生、降低出生缺陷的重要手段。本研究结果显示，7 446例孕妇中检出异常核型665例，异常核型检出率为8.9%，高于国内外其他文献报道的2.8%[2]和6.7%[3]。可能与本院临床医师及患者对产前诊断指征把握较为严格有关，同时，由于部分高风险孕妇对羊水穿刺有创性检查的担忧，往往会优先选择NIPT，只有NIPT 结果阳性才会继续进行产前诊断，也在一定程度上造成了异常检出率较高。

由表1可见，665例异常染色体核型中非整倍体异常核型419例(63.0%)，与相关文献报道结果基本一致[4]。其中21-三体最多，其次为性染色体非整倍体异常和18-三体，而非整倍体异常核型与正常核型组成的嵌合体、额外微小标记染色体和13-三体较少。大量研究表明，非整倍体产生的原因主要是生殖细胞在第1次或第2次减数分裂或受精卵卵裂时发生的不分离所致，而女性随着年龄的增长，卵巢功能退化及卵子质量下降会使减数分裂时纺锤体发生障碍的概率增加，从而造成染色体的不分离[5]。21-三体和18-三体综合征是最重常见的染色体非整倍体异常疾病，在新生儿中21-三体综合征发病率为1/800～1/600，18-三体综合征发病率为1/8 000～1/4 000，患儿均有严重的智力障碍，并伴多器官及组织畸形[6]。本研究中高风险孕妇21-三体发病率和18-三体发病率均显著高于新生儿，也证明了具有高风险指征的孕妇进行羊水染色体检查的必要性。其中21-三体中包括罗氏易位型21-三体25例，其发病机制可能为双亲之一为罗伯逊易位携带者或是染色体长臂复制形成了等臂染色体[7]。目前，常染色体非整倍体异常均无有效治疗办法，因其多表现出严重出生缺陷，在产前诊断后需立刻终止妊娠，以避免缺陷患儿的出生。本研究检出性染色非整倍体异常86例(13.0%)，这些性染色体非整倍体异常患儿临床表现主要为性腺发育不良、身高异常及生育障碍等，少数会出现语言行为异常及智力障碍[8]。性染色体非整倍体异常同样无法根治，但有改善症状的治疗方法，因此，通常临床医师在告知孕妇相关风险后应由其自行决定患儿去留。另外本研究中6例增加额外微小标记染色体的胎儿经检查夫妻双方染色体后2例胎儿遗传自母亲选择继续妊娠，4例胎儿为新发突变，新发突变病例进一步经微阵列比较基因组杂交技术检测后，其中2例标记染色体携带致病性的拷贝数变异而选择终止妊娠，2例标记染色体组成为随体及异染色质，无致病性而选择继续妊娠。

据文献报道，80.0%的染色体结构异常为家族遗传，少部分为新发突变[9]。本研究结果显示，665例异常染色体核型中检出染色体结构异常246例(37.0%)，其中平衡性结构异常因不涉及遗传物质的增减，一般无临床表现。但其中的染色体平衡易位及罗伯逊易位携带者在生育下一代时的生殖细胞减数分裂过程中平衡变异染色体可随机形成18个不同的配子，仅有2个配子能发育为正常胚胎或相互易位型胚胎，从而会直接影响妊娠结果，出现复发性流产、生化妊娠、死胎、生育染色体病患儿等[10-11]。染色体倒位携带者生殖细胞在减数分裂过程中与正常同源染色体配对交换，理论上讲能形成正常、倒位、部分重复或部分缺失4种不同配子，同样会对生殖异常具有一定的遗传学效应，其效应主要取决于倒位片段长度及其所含基因的致死效应[12]。因此，此类平衡性结构异常胎儿需结合超声、血清学筛查等其他检测结果综合判定，并告知夫妻双方进行染色体检查，明确染色体变异来源是遗传自父母还是新发，如为新发还需进一步运用分子遗传学技术检测，以明确胎儿是否伴染色体微缺失或微重复。临床医师在进行遗传咨询时需告知夫妇双方此胎儿在以后再次生育下一代时可能产生的影响，由夫妇双方自主选择继续妊娠或终止妊娠。而非平衡性染色体异常因有遗传物质的增加或缺失，通常会伴有超声检测结果异常，此类胎儿出生后会有明显的实质性器官发育异常及精神发育障碍，因此，孕妇需选择终止妊娠。

由表2可见，在产前诊断高风险指征中血清学筛查高/临界风险比例最高，其次为年龄高风险(生育年龄大于或等于35岁)，与相关文献报道结果一致[13]。血清学筛查因其无创、安全、价格低廉等特点，是35岁以下产妇较为普遍的筛查方法，但血清学筛查的检出率相对较低，具有较高的假阳性和假阴性[14]。为避免漏诊阳性病例，本院临床医师在进行遗传咨询时将血清学筛查临界风险(21-三体1/1 000～1/270、18-三体1/1 000～1/350)也纳入羊水穿刺产前诊断的高危指征。血清学筛查临界风险孕妇生育异常患儿的概率相较于其他指征低，故本研究中血清学筛查高/临界风险指征比例高达32.5%，而异常核型仅检出20例，异常核型检出率为0.8%，明显低于相关文献报道[15]。20例异常核型中21-三体10例，18-三体2例，性染色体数目异常2例，其他异常核型6例，也表明产前血清学筛查高/临界风险不仅可检出21-三体、18-三体和神经管畸形患儿，对性染色体数目异常及染色体结构异常也具有一定的预警作用。

临床将预产年龄大于或等于35岁的孕妇称为高龄孕妇，近年来，随着“二孩”政策的全面开放，高龄孕妇比例逐年升高。NEAGOS等[15]研究表明，在40～45岁孕妇中生育21-三体的比例高于25～30岁孕妇。CRANDALL等[16]研究表明，20岁女性生育21-三体的概率为1/2 000，但当母亲45岁时其概率则增加至1/40。因此，对高龄孕妇进行羊膜腔穿刺和胎儿染色体核型分析非常有必要。由表2也可见，单纯高龄孕妇异常检出率(6.6%)明显低于高龄合并其他指征的异常检出率(24.7%)，表明高龄孕妇如合并其他产前诊断检测指征会大大增加发生胎儿染色体异常的风险。由表2还可见，产前诊断高风险指征中异常核型检出率最高的指征为NIPT高风险(48.0%)，与BENN等[17]研究结果一致，说明NIPT对胎儿染色体核型异常特别是对21-三体的检出方面具有较高的准确性。NIPT技术因具有无创性、可重复性、检查时间早、灵敏度高、有商业保险赔付等优势，近年来，广泛用于胎儿21、18、13-三体及性染色体非整倍体异常的筛查。本研究中 NIPT高风险相关的产前诊断指征共检出异常核型179例，其中21-三体85例，18-三体16例，性染色体数目异常40例，其他染色体异常38例，与国内外相关文献报道结果基本一致[18]。表明NIPT 技术不同于目前的血清学筛查，对常见非整倍体染色体异常具有较高的灵敏度和特异度，同时，对其他染色体异常也可做出预警。但值得注意的是NIPT技术只能作为高精度的筛查技术，还不能作为临床诊断技术，对NIPT筛查高风险孕妇必须再次进行羊水穿刺进行产前诊断。

当夫妇一方染色体异常作为产前诊断高风险指征时通常为夫妇之一为平衡易位或倒位等平衡性结构异常携带者，此时生殖细胞在减数分裂过程中可随机形成正常或异常配子，胎儿有极大的可能形成非平衡性结构异常。本研究中夫妇一方染色体异常相关高风险指征共检出4例21-三体，1例18-三体，4例性染色体数目异常和149例其他染色体异常。也提示存在染色体异常夫妇在生育下一代时进行羊膜腔穿刺是非常有必要的。目前，羊水染色体分析结合超声诊断已成为产前诊断中最常用的方法，超声检测异常包括胎儿心脏异常、胎儿颈项透明层增厚，肢体发育不良、脉络丛囊肿等一项或多项软指标异常。本研究中孕中期超声检测异常81例，异常核型检出率为6.7%，低于相关文献报道[19]；这是因为本院针对部分一过性超声检测异常孕妇先建议其选择NIPT检测，NIPT高风险者再进一步做羊膜腔穿刺进行产前诊断。

本研究中出现40例非整倍体异常核型与正常核型组成的嵌合体，以及32例染色体结构异常核型与正常核型组成的嵌合体。羊水染色体的嵌合体存在真假性嵌合，胎儿本身的嵌合为真性嵌合，真性嵌合发生的概率往往比较低，会对胎儿智力、生长发育造成影响。而假性嵌合是由羊膜腔穿刺过程中的母体细胞污染、胎儿细胞有丝分裂异常及羊水细胞突变等因素所致，需进一步给予脐带血染色体核型检查以验证真假性嵌合。本研究经与脐带血染色体核型检查结果比较，40例非整倍体异常核型与正常核型组成的嵌合体中有8例真性嵌合和11例假性嵌合，32例染色体结构异常核型与正常核型组成的嵌合体中有5例真性嵌合和10例假性嵌合。其他患儿因嵌合比例较低及其他个人原因未给予脐带血染色体核型分析验证，本研究也未追踪到其妊娠结局。胎儿真性嵌合的临床表型取决于嵌合体中异常核型比例、异常核型类型和所涉及基因组大小和功能等，另外也需参考超声检测及家族史等各项内容，进行充分的遗传咨询并告知患者可能的风险，由其家属自行决定继续妊娠或终止妊娠。

综上所述，对产前诊断高风险指征孕妇进行羊水细胞培养及染色体核型分析可及时检测出染色体异常胎儿，有效降低新生儿出生缺陷发生率，从而达到优生优育的目的，具有较高的临床应用价值和指导意义。