超高效液相色谱–串联质谱法测定人血清中4 种镇静催眠类药物

于浩洋，李颜岩，冯静，华正罡

(辽宁省疾病预防控制中心，沈阳 110005)

随着生活节奏日益加快、竞争日益加剧，越来越多的人产生焦虑障碍，从而给当今人类的身心健康造成严重威胁。焦虑是人们生活中产生的一种正常的生理反应，而焦虑、紧张过度或出现某些病理性焦虑时称为焦虑障碍。焦虑障碍会使患者的生活质量和社会功能下降，还会引发躯体功能障碍，导致其它疾病的发病率升高［1］。其中焦虑和失眠是较为常见的症状，也是各型神经症的中心症状。镇静催眠药是一类中枢神经系统抑制药，第1 代镇静催眠药为巴比妥类药，其不良反应大，抑制呼吸，过量可致死，治疗安全范围小，易蓄积中毒，有明显潜在的成瘾性。目前临床应用广泛的是第2 代镇静催眠类药物［2］，其具有较强的多巴胺受体和5-羟色胺受体阻断作用［3］，主要包括氯氮平、氟哌定醇、氟奋乃静、丙咪嗪等。氯氮平为二苯二氮卓类抗精神病药，是一种新型广谱抗精神病药物，对脑内5-羟色胺(5-HT2A)受体和多巴胺(DA1)受体的阻滞作用较强，吸收迅速；氟哌啶醇是一种典型丁酰苯类抗精神分裂药，有较强的多巴胺受体拮抗作用，主要用于多种急、慢性精神分裂症、躁狂症、抽动秽语综合症［4］；盐酸氟奋乃静属于吩噻嗪类药物，具有较强的抗精神病作用和轻度的镇静作用；丙咪嗪为三环类抗抑郁药，有较强的抗抑郁作用。

适量服用镇静催眠类药物可改善患者焦虑障碍症状和生活质量，服用过量则会引起严重的椎体外系症状（EPSs）［5］。近年来因该药物服用过量引起的急性中毒事件发生率很高［6］。中毒程度与药物种类、血药浓度密切相关，迅速定性、定量检测中毒患者的血药浓度对临床抢救具有重大意义［7–9］。

目前测定镇静催眠类药物的方法主要有高效液相色谱（HPLC）法［10–12］、气相色谱–质谱（GC–MS）法［13–14］以及液相色谱–串联质谱（LC–MS／MS）法［15–16］。HPLC 法的灵敏度和特异性相对较低，无法适应高灵敏度要求的中毒样本血药浓度检测；GC–MS 法不适合检测难挥发、热稳定性差的镇静催眠药；LC–MS／MS 法的多通道检测可一次性检测多种化合物且无干扰，可缩短分析时间，灵敏度比GC–MS 法高。目前大多数高效液相色谱–串联质谱法的前处理采用液液萃取或固相萃取等方式，操作繁琐，耗时长，样本用量大，无法适应中毒样本快速定性定量的要求。笔者建立一种以乙腈沉淀蛋白的HPLC–MS／MS 法同时测定人血清中氯氮平、氟哌啶醇、氟奋乃静和丙咪嗪的浓度，操作简单，可快速测定已中毒患者的血药浓度。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱–串联质谱仪：Acquity Xevo TQ 型，美国沃特世公司。

涡旋振荡器：Lab Dancer 型，德国艾卡公司。

高速冷冻离心机：Thermo ST16R 型，美国赛默飞世尔公司。

氯氮平标准物质：纯度不小于99.6%，标准物质编号为CCHM701181，美国CATO 公司。

氟哌啶醇标准物质：纯度不小于99%，标准物质编号为CDCT–C13801600，德国Dr. Ehrenstorfer公司。

盐酸氟奋乃静标准物质：纯度不小于99%，编号为CDCT–C14059400，德国Dr. Ehrenstorfer 公司。

丙咪嗪标准物质：纯度不小于99%，编号为CDCT–C13402100，德国Dr. Ehrenstorfer 公司。

乙腈：色谱纯，美国费希尔公司。

甲酸：优级纯，北京化工厂有限责任公司。

血清样品来自于辽宁省疾病预防控制中心。

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国沃特世公司）；柱温：40℃；样品室温度：4 ℃；流动相：A 相为乙腈，B 相为0.05%甲酸溶液，流量为0.3 mL／min；梯度洗脱程序见表1；进样体积：10 μL。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 串联质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI+）；毛细管电压：2.64 kV；离子源温度：350℃；脱溶剂气流量：650 L／min；4 种镇静催眠类药物质谱参数见表2。

表2 4 种镇静催眠类药物的质谱参数

1.3 样品预处理

移取100 μL 血清样品于3 mL 离心管中，加入300 μL 乙腈，震荡涡旋3 min，以15 000 r／min 离心15 min，取上清液250 μL，加入250 μL 水，涡旋均匀，过0.22 μm 滤膜，待测。

1.4 溶液配制

标准储备溶液：分别准确称取4 种镇静催眠药物标准物质，用乙腈溶解，配制成盐酸氟奋乃静、氟哌啶醇、氯氮平、丙咪嗪的质量浓度分别为0.732、0.802、1.115、0.888 8 mg／mL 的4 种镇静催眠药的单一标准储备溶液。

混合标准储备液：分别移取适量4 种镇静催眠药标准储备溶液于10 mL 容瓶中，用乙腈定容至标线，配制成盐酸氟奋乃静、氟哌啶醇、氯氮平、丙咪嗪的质量浓度分别为0.55、1.20、31.36、35.55 μg／mL的混合标准储备溶液，于–20℃下保存。

系列混合标准工作溶液：分别吸取适量混合标准储备溶液于适量乙腈中，配制成系列混合标准工作溶液，于–20℃下保存，4 种镇静催眠药的质量浓度见表3。

表3 系列混合标准工作溶液中各化合物的质量浓度μg／mL

基质系列标准工作溶液：准确吸取90 μL 血清，分别加入10 μL 系列混合标准工作溶液，得4种镇静催眠药的质量浓度见表4，按1.3 处理后得基质系列标准工作溶液。

表4 基质系列标准工作溶液中各化合物的质量浓度ng／mL

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

4 种镇静剂均属于含有氮原子的碱性化合物，适用于ESI 正离子模式扫描，可获得丰度较高的［M+H］+母离子，采用离子扫描方式选择响应最大的两个碎片作为子离子，确定定量离子对和定性离子对，并对碰撞能量等质谱条件进行优化。优化的质谱参数见表2。

2.2 色谱条件优化

4 种化合物均采用正离子模式进行扫描，在流动相中加入适量甲酸有利于化合物的电离，可提高离子响应。分别考察0.05%、0.1%、0.15%甲酸溶液对测定结果的影响。结果表明，在上述3 种浓度甲酸溶液下4 种化合物的峰形与响应值均未见显著性差异，最终选择0.05%甲酸溶液作为流动相。

当样品溶液的溶剂强度高于流动相溶剂强度时，易造成峰展宽、峰分叉现象。采用乙腈提取血清样品，按照乙腈与水体积比为1∶1 加入水，混匀后进样测定，可有效防止溶剂效应、改善峰形以及提高响应值。

2.3 前处理条件优化

蛋白质沉淀是一种较为常用的样本前处理方法，能防止色谱分析过程中色谱柱的堵塞和质谱分析过程中的离子源污染。分别采用乙腈、乙醚、二氯甲烷沉淀血清中蛋白质。由于乙醚与二氯甲烷不可作为溶剂直接上机进样，因此采用乙醚和二氯甲烷沉淀蛋白后，分别于40 ℃水浴氮气吹干，用乙腈–水（1+1）溶液复溶后进样。试验结果表明，采用二氯甲烷沉淀蛋白的回收率低于乙腈与乙醚，用乙醚沉淀时需要氮气吹干再复溶，操作繁琐，与急性中毒患者快速定性、定量的诉求相悖，因此最终选择乙腈沉淀蛋白。

2.4 线性范围的设定

根据各药物有效血药浓度设定其线性范围。根据神经精神药理学与药物精神病学协会（AGNP）治疗药物监测（TDM）专家组指导方案，推荐氯氮平的有效浓度为350～600 μg／L［17］；于欣等［18］通过对既往有关氟哌啶醇治疗精神分裂症浓度–效应分析，提出氟哌啶醇治疗精神分裂症合宜的血药浓度为2.7～22.7 μg／L；盐酸氟奋乃静血药浓度参考值范围为0.6～2.4 μg／L［19］；丙咪嗪为三环类抗抑郁药，一般认为各三环类抗抑郁药的中毒浓度均不低于500 μg／L［20］。线性范围包含有效血药浓度范围，线性范围最高浓度包含实验室警戒浓度，最终设定氯氮平为26.1～1 045.3 μg／L、氟哌啶醇为1.0～40.1 μg／L、盐酸氟奋乃静为0.5～18.3 μg／L、丙咪嗪为29.6～1 185.1 μg／L。

2.5 线性方程和检出限

在1.2 仪器条件下，测定1.4 配制的基质系列标准工作溶液，以待测化合物的色谱峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标绘制标准工作曲线。以3 倍信噪比对应的浓度作为方法检出限。4 种镇静催眠类药物的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表5。

表5 线性范围、线性方程、相关系数及检出限

由表5 可知，4 种镇静催眠类药物在各自的质量浓度范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数均均大于0.995，氯氮平、氟哌啶醇、丙咪嗪的检出限为0.03 μg／L，氟奋乃静的检出限为0.06 μg／L。

2.6 加标回收和精密度试验

准确吸取18 份混合均匀的空白血清样品90 μL 作为本底，每6 份为1 组共3 组，分别进行低、中、高3 个浓度水平的加标回收试验，试验数据见表6 所示。

表6 加标回收和精密度试验结果

由表6 可知，4 种化合物测定结果的相对标准偏差为1.1%～8.9%，加标样品的平均回收率为90.7%～111.9%，说明该法精密度和准确度良好。

3 结语

建立了一种HPLC–MS／MS 法测定人血清中4种镇静催眠类药物浓度。采用乙腈蛋白沉淀处理样品，简单易行。该法的灵敏度、回收率满足生物样本的分析要求，本法可实现急性中毒样本的快速检测。