多管发酵法在居民日常生活饮用水微生物检测中的应用

河南省荥阳市疾病预防控制中心（450100）杨丽娟

水是人体必不可缺的生命之源，有助于保持体温，改善机体组织细胞液，促进新陈代谢，然而随着我国经济持续发展，生活工业用水大量增加，日常饮用水污染也在不断加重，严重影响居民生活质量[1][2]。过滤、消毒等是既往处理日常生活饮用水中微生物的常用方法，虽能减少水中微生物含量，但由于生活环境较为复杂，日常生活饮用水污染现象仍未得到明显抑制[3]。同时，有学者指出，菌落总数与游离余氯超标是居民日常生活饮用水水质不合格的原因[4]。因此，为保障日常生活饮用水安全，维护居民健康，及时实施科学有效的日常生活饮用水检验方案是重要前提。基于此，本研究随机抽取597份居民日常生活饮用水水样，探讨多管发酵法在微生物检测中的应用价值，旨在为科学选取水质检测方法提供循证指导。具体分析如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2019年10月～2020年4月居民日常生活饮用水水样597份，所有样本均严格遵循生活饮用水标准检验方法水样采集与保存流程进行。根据不同检验方式分为对照组（298份）、实验组（299份），其中对照组水样来源：32份出厂水、130份管网末梢水、136份二次供水；实验组水样来源34份出厂水、128份管网末梢水、137份二次供水。两组水样来源资料均衡可比（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 对照组 采用滤膜法检验。准备微孔滤膜（0.45μm，购自上海摩速科学器材有限公司）、试管、显微镜、无齿镊子、不锈钢手提式灭菌器（购自北京金洋万达科技有限公司）、恒温培养箱（购自上海飞越实验仪器有限公司）等相关仪器及设备。于烧杯内置入微孔滤膜，注入蒸馏水，酒精灯煮沸灭菌。灭菌后以无菌镊子夹起微孔滤膜，置于无菌滤床上方，避免微孔滤膜粗糙面向下。注入日常生活饮用水水样（100ml），开启阀门，实施抽滤操作，抽滤条件为-0.05Pa。过滤完成后实施抽气，时间控制在5s内，抽气过程中需关闭闸门，取出过滤器。再次以无菌镊子夹起微孔滤膜，放入红亚硫酸钠培养基内，保证残留细菌面朝上，最后置入37℃恒温箱内进行培养，培养时间为22～26h。若出现产气情况，则表示总大肠菌群呈阳性，计算每升水样中总大肠菌群数的最近似值。

1.2.2 实验组 采用多管发酵法检验。准备微孔滤膜、试管、显微镜、无齿镊子等相关仪器及设备。首先培养总大肠菌群。后于装有单料乳糖蛋白胨培养液（10ml）试管内注入日常生活饮用水水样（1.0ml），而单料乳糖蛋白胨培养液配制方法为将蛋白胨（25g）、氯化钠（15g）、乳糖（15g）分别加入蒸馏水（1000ml）中，并使用牛肉膏（10g）进行加热溶解，将pH值调整至7.1～7.5范围内，后加入溴甲酚紫乙醇溶液（2ml，浓度为1.5%）充分混匀，分别装入试管内，再放于高压蒸汽灭菌器（110℃～120℃）内充分灭菌15～20min，置入冰箱内贮存待检。同时于装有双料乳糖蛋白胨培养液（10ml）的试管中注入日常生活饮用水水样（10ml），并在装有生理盐水（9ml）的试管中注入日常生活饮用水水样（1ml），充分混匀后，将单料乳糖蛋白胨培养液注入混合液（1ml）内。污染严重的日常生活饮用水水样可适度增大稀释力度。接种完成后，将样本放入37℃恒温箱内进行培养，时间约为24h。24h后取出，若试管内未出现产酸产气情况，则表示大肠菌群呈阴性；若试管内出现产酸产气情况，则尝试将试管放于伊红美蓝琼脂板培养基上方转种，伊红美蓝琼脂板培养基制备方法为将琼脂（25g）注入蒸馏水（500ml）中，加热，充分溶解，后均匀混合磷酸氢二钾（1.5g）、蛋白胨（8g）至充分溶解，分装至烧瓶内，接受灭菌、冷却、凝固等处理。转种后再次放进恒温箱内培养，密切监测菌落形态。

附表 两组微生物检出情况比较[n(%)]

1.3 观察指标 ①比较两组饮用水水样检验合格率，其中日常生活饮水中细菌总数＜100个/ml为合格。②比较两组微生物检出情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件处理数据，计数资料用n（%）表示、χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组饮用水水样检验合格率 实验组饮用水水样检验总合格率96.32%高于对照组的77.52%（P＜0.05）。

2.2 微生物检出情况 两组杂菌、大肠菌群检出率比较无显著差异（P＞0.05）；实验组大肠埃希菌、耐热大肠菌群检出率高于对照组（P＜0.05），见附表。

3 讨论

据世界卫生组织调查显示，受水污染问题影响，全球约有12亿人出现肠道传染性疾病，其中死于水污染疾病儿童人数高达400万[5]。故重点把控居民日常生活饮用水质量具有重要意义。

大肠菌群是导致肠道疾病发生的病菌总称，也是监测食用水源及餐具等生活用品是否遭受粪便污染的主要标准，我国食品卫生将其纳入主要检测范围内[6]。微生物检验是评估日常生活饮用水质量的重要手段，一定程度可确保水质在流行病学方面的安全性及可靠性。近年来，滤膜法凭借监测结果重现性好、精密性高，在饮用水水质微生物检测中得到广泛运用，尤其是清洁度较高的水样，但截留在滤膜上大肠杆菌含量超标，会导致培养后过滤膜上大肠杆菌菌落过于密集，无法精准计数菌落，影响测定结果。同时，滤膜法检验结果准确性和可靠性与检验人员经验、技术水平也存在一定关系，且确认结果约需48h，不适用于预防应对突发公共卫生事件。多管发酵法是目前监测粪大肠杆菌群标准方法，具有技术成本低、结果精准性高等优点，可通过粪大肠菌群发酵乳糖、产酸产气需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，准确计数粪大肠杆菌群[7]。本研究结果显示，实验组饮用水水样检验总合格率96.32%高于对照组77.52%（P＜0.05）。可见多管发酵法可有效提高饮用水水样检验合格率。此外，刘笑笑等[8]研究显示，按照JJF 1059.1.2012《测定不确定度评定与表示》和SN/T4091-2015《食品微生物学测量不确定度评估指南》，多管发酵法适用于类似条件下总大肠菌群测定不确定度的评估。本研究数据表明，实验组大肠埃希菌、耐热大肠菌群检出率高于对照组（P＜0.05）。提示多管发酵法在检出居民日常生活饮用水中大肠埃希菌、耐热大肠菌群等微生物中具有一定积极效应。因此，为减少饮用水污染程度，相关管理部门应从源头做起，及早检测饮用水水质，明确总大肠菌群含量，加强对日常生活饮用水所在区域消毒、灭菌等管理工作，同时，也要加大宣传力度，广泛普及饮用水安全知识，从根本上预防和减少居民日常生活饮用水源污染问题。

综上可知，多管发酵法可有效提高居民日常饮用水水样检验总合格率，检出大肠埃希菌、耐热大肠菌群等微生物。