靶向VEGFA调控MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路在结直肠癌血管生成中的作用及机制

徐润强　刘海盛

【摘要】 目的：探究靶向血管内皮生长因子A（vascularendothelial growth factor A， VEGFA）调控促分裂原活化的蛋白激酶/细胞外调解蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular regulated protein kinase， MAPK/ERK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3- kinase/protein kinase B， PI3K/Akt）信号通路在结直肠癌血管生成中的作用及机制。方法：收集本院2015年1月-2019年12月82例结直肠癌患者癌组织及癌旁正常组织，使用qRT-PCR检测患者癌组织、癌旁正常组织中VEGFA水平，分析VEGFA水平与患者临床病理特征的关系。将SW480细胞分为五组，分别为对照组（正常人结肠细胞），空白组（无转染质粒），pMIR-miR-29b组（转染miR-29b），MAPK/ERK组（转染miR-29b后添加MAPK/ERK信号通路抑制剂PD98059），PI3K/Akt组（转染miR-29b后添加PI3K/Akt信号通路抑制剂wortmanin）。检测各组细胞中VEGFA、MAPK/ERK及PI3K/Akt信号通路靶蛋白ERK、Akt、mTOR、Bcl-2的表达水平。将各组细胞移植至裸鼠，建立结直肠癌裸鼠转移瘤模型，观察各组裸鼠移植瘤生长情况，检测各组裸鼠肿瘤微血管密度变化情况。结果：癌组织VEGFA表达水平高于癌旁正常组织（P<0.05）;癌组织内Ⅲ、Ⅳ期患者VEGFA mRNA水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.05），淋巴结转移患者VEGFA表达水平高于无淋巴结转移患者（P<0.05）。与對照组相比，空白组、pMIR-miR-29b组、MAPK/ERK组、PI3K/Akt组VEGFA、ERK、Akt、mTOR、Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平均上升（P<0.05）。MAPK/ERK组与PI3K/Akt组肿瘤重量、微血管密度均低于空白组（P<0.05），pMIR-miR-29b组裸鼠微血管密度、肿瘤重量均明显低于MAPK/ERK组与PI3K/Akt组（P<0.05）。结论：VEGFA可有效下调MAPK/ERK及PI3K/Akt信号通路，从而抑制结肠癌血管新生，为临床治疗结直肠癌提供了新的临床依据。

【关键词】 VEGFA MAPK/ERK PI3K/Akt 结直肠癌 血管生成

[Abstract] Objective： To investigate the effect of vascular endothelial growth factor A （VEGFA） on mitogen activated protein kinase/extracellular regulated protein kinase （MAPK/ERK） and the role and mechanism of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B （PI3K/Akt） signaling pathways in colorectal cancer angiogenesis. Method： A total of 82 patients with colorectal cancer from January of 2015 to December of 2019 in our hospital were collected. The levels of VEGFA in cancer tissue and normal tissue were detected by qRT PCR， and the relationship between VEGFA level and clinicopathological characteristics was analyzed. SW480 cells were divided into five groups： control group （normal colon cells）， blank group （without transfection plasmid）， pMIR-miR-29b group （transfected with miR-29b）， MAPK/ERK group （adding MAPK/ERK signal pathway inhibitor PD98059） and PI3K/Akt group （adding PI3K/Akt signal pathway inhibitor wortmanin after miR-29b transfection）. The expression levels of VEGFA， MAPK/ERK， ERK， Akt， mTOR and Bcl-2 were detected. The cells were transplanted into nude mice to establish colorectal cancer metastasis model in nude mice. The growth of transplanted tumor and the change of tumor microvessel density were observed. Result： The expression level of VEGFA in cancer tissue was higher than that in the normal tissues （P<0.05）， the level of VEGFA mRNA in stage Ⅲ and Ⅳ patients was higher than that in stage Ⅰ and Ⅱ patients （P<0.05）， and that of patients with lymph node metastasis was higher than that in patients without lymph node metastasis （P<0.05）. Compared with the control group， the expression levels of VEGFA， ERK， Akt， mTOR， Bcl-2 mRNA and protein in blank group， pMIR-miR-29b group， MAPK/ERK group， PI3K/Akt group were all increased （P<0.05）. The tumor weight and microvessel density of MAPK/ERK group and PI3K/Akt group were lower than that in blank group （P<0.05）， and that of pMIR-miR-29b group was significantly lower than those of

MAPK/ERK group and PI3K/Akt group （P<0.05）. Conclusion： VEGFA can effectively down regulate MAPK/ERK and PI3K/Akt signaling pathways， thus inhibiting angiogenesis of colon cancer， which provides a new clinical basis for clinical treatment of colorectal cancer.

[Key words] VEGFA MAPK/ERK PI3K/Akt Colorectal cancer Angiogenesis

First-authors address： Zengcheng District Peoples Hospital， Guangzhou 511300， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.09.008

在肿瘤进展过程中，病理性血管生长处于激活状态，从而促进肿瘤组织发生远处转移。肿瘤在生长及转移过程中，血管内皮生长因子A（vascularendothelial growth factor A， VEGFA）可有效促进细胞分裂增殖。有临床研究显示，结直肠癌患者血清中VEGFA表達水平与其血管新生状态密切相关，是患者预后的独立预测因子[1]。促分裂原活化的蛋白激酶/细胞外调解蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular regulated protein kinase，MAPK/ERK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3- kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路与肿瘤细胞血管内皮细胞生长及血管新生有重要作用[2-3]。有研究表明，VEGFA下降可导致MAPK/ERK、PI3K/Akt信号通路活化抑制，从而发挥抗血管生成作用[4]。但结直肠癌肿瘤发生发展的过程中血管生成的机制尚不清楚，本研究解释了VEGFA在结直肠癌发生、血管生成中的作用，为直肠癌靶向治疗提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 收集本院2015年1月-2019年12月

82例结直肠癌患者癌组织及癌旁2 cm以上正常组织，收集患者临床病例资料，本研究经医学伦理会批准，患者均自愿参加。纳入病例资料均完整，患者术前均未经放化疗或激素治疗。结肠SW480细胞系购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。BALB/C裸鼠100只，均为雄性，平均鼠龄（2.31±0.14）个月，平均体重（240±50）g。本研究进行的动物实验均符合当地实验动物使用指南。

1.2 主要试剂 胎牛血清、质粒、氯仿、Trizol、DEPC、PCR引物、Ex Taq DNA聚合酶、PCR试剂盒、RNA提取试剂盒、VEGFA、ERK、Akt、mTOR、Bcl-2引物、GAPDH、山羊血清、miR-29b慢病毒[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。

1.3 主要仪器 SH-523凝胶成像系统（杭州申花科技有限公司）、Microfuge台式离心机、MR-96A酶联免疫检测仪（美国贝克曼库尔特有限公司）、HH-US电热恒温水浴箱（上海赫田科学仪器有限公司）、PCR仪器、SDS-PAGE蛋白电泳仪、PCS-150型CO2细胞培养箱[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]、DM2500荧光显微镜（德国徕卡显微系统）。

1.4 方法

1.4.1 细胞实验分组 取生长期的结肠SW480细胞，随机分为五组，分别为对照组（正常人结肠细胞），空白组（无转染质粒），pMIR-miR-29b组（转染miR-29b），MAPK/ERK组（转染miR-29b后添加MAPK/ERK信号通路抑制剂PD98059），PI3K/Akt组（转染miR-29b后添加PI3K/Akt信号通路抑制剂wortmanin）。

1.4.2 组织及细胞RNA提取 使用Trizol试剂使细胞充分裂解，室温放置10 min后提取总RNA备用。

1.4.3 qRT-PCR扩增 在实时荧光定量PCR上按照标准操作步骤进行反应，循环条件：95 ℃下4 min;59 ℃，30 s;72 ℃，30 s，共循环32个周期;72 ℃下退火10 min，4 ℃保存。PCR扩增序列见表1。

1.4.3 Western blot蛋白表达 培养细胞48 h后，弃去上清液，使用PBS清洗2次，加入细胞裂解液，离心后收集上清液。按照标准程序操作SDS-PAGE蛋白电泳仪，停止电泳后取下凝胶，转印后使用含5%脱脂奶粉封闭。按照试剂盒程序进行一抗孵育、二抗孵育，使用电化学发光法检测蛋白表达[5]。

1.4.4 裸鼠成瘤实验、分组、生长状况 将结肠SW480细胞接种至BALBC裸鼠右侧腹部皮下，1 mL/只，共分为五组，20只/组，对照组裸鼠不进行任何处理，空白组接种无转染物的SW480细胞，pMIR-miR-29b组接种miR-29b质粒的SW480细胞，MAPK/ERK组接种转染miR-29b后添加MAPK/ERK信号通路抑制剂PD98059的细胞，PI3K/Akt组接种转染miR-29b后添加PI3K/Akt信号通路抑制剂wortmanin的细胞。接种6周后，处死裸鼠。处死裸鼠后进行肿瘤称重，观察肿瘤转移情况。

1.4.5 免疫组化 将标本进行免疫组化染色[6]，脱蜡切片后使用枸橼酸钠缓冲液进行抗原修复。使用兔血清进行封闭，清除血清后加入一抗;使用PBS清洗后加入二抗，按照标准程序进行DAB染色，用自来水冲洗终止。使用高倍镜（×400）计算染色血管数，取2个视野微血管数平均数进行统计。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料使用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料使用率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGFA表达及其与临床病理特征的关系 癌组织VEGFA表达水平高于癌旁正常组织（P<0.05）;癌组织内Ⅲ、Ⅳ期患者VEGFA mRNA水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.05），淋巴结转移患者VEGFA表达水平高于无淋巴结转移患者（P<0.05）。见表2。

2.2 各组细胞VEGFA与ERK、Akt、mTOR、Bcl-2的mRNA及蛋白水平比较 与对照组相比，其余四组VEGFA、ERK、Akt、mTOR、Bcl-2的mRNA及蛋白表达水平均上升（P<0.05），MAPK/ERK组、PI3K/Akt组可在一定程度上缓解上升趋势。见表3、4和图1。

2.3 各组裸鼠肿瘤重量、微血管密度比较 MAPK/ERK组与PI3K/Akt组肿瘤重量、微血管密度均低于空白组（P<0.05），pMIR-miR-29b组裸鼠微血管密度、肿瘤重量均明显低于MAPK/ERK组与PI3K/Akt组（P<0.05）。见表5。

3 讨论

血管生成对于肿瘤生长及转移十分重要。有研究指出，VEGF在癌症患者组织中表达水平明显高于正常组织[7]。VEGF通过激活Akt/PI3k/MAPK等血管内皮细胞增殖及侵袭，从而促进血管生成[8-9]。因此，本研究选取靶向VEGFA基因调控作用进行探究。

有研究显示，VEGFA是miR-29b是直接靶基因[10-11]。为进一步研究靶向VEGFA对血管新生的作用机制，本研究结果显示癌组织VEGFA表达水平高于癌旁正常组织（P<0.05），癌组织内Ⅲ及Ⅳ期患者VEGFA mRNA水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.05），淋巴结转移患者VEGFA表达水平高于无淋巴结转移患者（P<0.05）。提示在结直肠癌发展过程中伴有VEGFA的过表达，从而作用于肿瘤生长及转移[12]。根据临床研究，VEGFA是一种二聚糖蛋白，可有效促进血管内皮细胞增生和凋亡，进而增加肿瘤血管通透性[13-14]。朱凯旋等[15]研究发现，VEGFA水平与结直肠癌患者不良结果呈正相关。

本研究通過设置五组细胞实验进行探究，结果显示过表达miR-29b可抑制VEGFA基因，从而下调ERK、Akt、mTOR、Bcl-2的表达，从而抑制癌组织血管新生。胡建新等[16]研究显示，VEGFA可通过MAPK/ERK，PI3K/Akt调控肿瘤血管新生，与本研究结果一致。李力等[17]研究指出，VEGFA信号传导被VEG中和抗体阻断会导致肿瘤血管生成受损。本研究中与正常裸鼠相比，MAPK/ERK组与PI3K/Akt组肿瘤重量低于空白组（P<0.05），pMIR-miR-29b组裸鼠微血管密度、肿瘤重量明显减少，MAPK/ERK组与PI3K/Akt组微血管密度均低于空白组（P<0.05）。提示miR-29b可抑制血管生成，VEGFA可有效通过调节MAPK/ERK与PI3K/Akt信号通路促进血管生成[18-19]。另闫陶然等[20]发现，mTOR可刺激血管内皮细胞中PI3K并促进细胞迁移。此外，朱晓志等[21]发现MAPK与PI3K参与到VEGF介导的血管生成中，从而调控血管新生过程。

综上所述，靶向VEGFA通过负调节MAPK/ERK与PI3K/Akt信号通路抑制结直肠癌中的血管生成，同时为临床进一步了解VEGFA低表达治疗效果提供依据。但本研究只检测了微血管密度这一指标，后期试验将添加小管生成试验等体外实验等证实本研究观点，进而丰富结直肠癌肿瘤发生发展机制。

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（收稿日期：2020-12-31） （本文编辑：周亚杰）