三种四物汤剂型中指标成分含量比较*

李敏兰，王瑞生

(1．河南中医药大学第三附属医院药学部； 2.河南中医药大学, 郑州 450000)

四物汤是中药的经典方剂之一，由熟地、当归、白芍和川芎四味药配伍而成，是从《金匮要略》中的芎归胶艾汤中减去阿胶、艾叶、甘草而成，仅有熟地黄12 g、当归12 g、川芎8 g和白芍10 g组成。最早见于《仙授理伤续断秘方》，用于治疗外伤淤血作痛; 宋代《太平惠民和剂局方》亦有收录，用于治疗妇人诸疾。本方治营血虚滞证，方中熟地甘温味厚质润，入肝、肾经，为补血要药，故为君药。当归甘辛温，归肝、心、脾经，为补血良药，兼具活血作用，且为养血调经要药，故为臣药。佐以白芍养血益阴；川芎活血行气。四药配伍，共奏补血调血之功[1]。近年来，对四物汤质量的研究方面已有文献[2-5]报道，但不完善。

四物汤是传统医学补血的代表方剂，具有补血调血功效。方中药物的有效成分比较明确，便于含量测定。在传统经方基础上，以中医药理论为指导，对传统汤剂进行剂型改革，并最大限度地保持原汤剂的成分，以水为提取溶剂，运用现代生产设备，将四物汤制成颗粒剂，该剂型克服了传统汤剂煎煮、携带、服用、贮存不便等缺点，具有质量可控、药材利用率高等特点[6-7]。本实验采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)同时测定四物汤颗粒剂、配方颗粒剂和传统汤剂中5-羟甲基糠醛、阿魏酸、毛蕊花糖苷的含量，分析其成分含量的差异性，结合四物汤标准汤剂的研究，进一步考察四物汤颗粒剂、配方颗粒剂各项指标的合理性与可行性，为四物汤的临床应用和工业化生产提供科学依据。

1 材料

YP10002电子天平(上海衡际科学仪器有限公司)，SECURA225D-1CN万分之一天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，电磁炉，H-1600台式高速离心机(上海利鑫坚离心机有限公司)，Waters 2487高效液相。熟地黄(批号：201811W-S2)、当归(批号：180413)、白芍(批号：180508H)、川芎(批号：180416)，上述药材均购于河南中原正信药行。按《中国药典》2015年版[8]相关药材项下要求进行检测，均符合要求。5-羟甲基糠醛、阿魏酸对照品(成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS020078、PS000828)、毛蕊花糖苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110773-201806)。水为自制超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 四物汤颗粒剂、配方颗粒剂及传统汤剂制备

2.1.1 四物汤颗粒剂前期 根据处方来源，选择水为溶剂，以5-羟甲基糠醛、芍药苷、毛蕊花糖苷成分含量及出膏率为指标[9]，通过正交试验优选提取工艺。按处方配比称取药材(熟地黄60 g、当归60 g、白芍50 g与川芎40 g)，减压浓缩喷雾干燥处理，得颗粒剂(浸膏)得颗粒剂样品。

2.1.2 配方颗粒剂 分别称取(熟地黄60 g、当归60 g、白芍50 g与川芎40 g)，根据配方颗粒制备工艺[9]分别制备熟地黄、当归、川芎、白芍浸膏，将制得的4个单味药浸膏混匀，得配方颗粒剂(浸膏)水搅拌使溶解，冷却后加水定容至1 L，得配方颗粒样品。

2.1.3 传统汤剂 称取处方(熟地黄60 g、当归60 g、白芍50 g与川芎40 g)药材，筛网过滤，合并煎液，加水定容至1 L，得传统汤剂样品。

2.2 色谱条件

2.2.1 流动相及流动相比例的选择[2]以乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱: 0～20 min，乙腈5%→10%；20～30 min，乙腈10%→13%；30～40 min，乙腈为 13%→20%；40～45 min，乙腈为20%；45～65 min，乙腈为 20%→45%为流动相；柱温35 ℃。

2.2.2 检测波长的选择 对5-羟甲基糠醛进行紫外全波长扫描，发现其在283 nm下吸收度最高，而阿魏酸和毛蕊花糖苷的吸收峰相对降低，比较不同波长280、290、275 nm，综合结果显示，在290 nm波长下样品色谱中5-羟甲基糠醛、阿魏酸和毛蕊花糖苷分离最好，且吸收度相对较高，故选取290 nm为最佳波长。

2.2.3 优选色谱条件色谱柱 ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×250.0 mm，5-Micron)；二极管阵列检测器；流速1.0 mL·min-1；检测波长290.0 nm[8]；柱温35.0 ℃。

2.3 对照品溶液制备 分别称取5-羟甲基糠醛0.09 mg、阿魏酸0.09 mg、毛蕊花糖苷0.48 mg的标准品，置于5 mL容量瓶中，加色谱甲醇至刻度，摇匀，制得浓度分别为5-羟甲基糠醛0.02 mg·mL-1、阿魏酸0.02 mg·mL-1、毛蕊花糖苷0.10 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液制备 吸取四物汤汤剂、四物汤配方颗粒、四物汤颗粒样品各4 mL，加入甲醇6 mL，放置2 h，超声处理20 min，取出，放冷，离心，取上清液置10 mL量瓶中，加入质量分数60%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5 线性关系考察 取上述混合标准品溶液适量过0.45 μm微孔滤膜，分别进样2、5、8、10、12、14、16、20 μL按上述条件进行检测，测定其各自峰面积。做出对应的标准曲线，y表示高效液相测定的峰面积，x表示各有效成分的质量。得线性回归方程分别为y=11 289 841.0 x+41 127.2(r=0.999 9)、y=3 231 605.7x +11 970.0(r=0.999 9)、y=946 844.0x+10 418.0(r=0.999 9),线性范围分别为0.036～0.357，0.035～0.350，0.192～1.192 μg。

2.6 精密度 取混合标准品溶液连续进样5次，测得峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为5-羟甲基糠醛2.69%、阿魏酸1.55%、毛蕊花糖苷1.64%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性 取同一样品每隔一段时间进样1次,测得RSD分别为5-羟甲基糠醛2.64 %、阿魏酸1.81%、毛蕊花糖苷2.76%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 重复性 取同一批样品,按供试品溶液的制备方法平行制备5份，分别进样，RSD分别为5-羟甲基糠醛2.92%，阿魏酸2.35%，毛蕊花糖苷2.86%，结果证明重复性良好。

2.9 加样回收率实验 设计3组不同浓度样品进行加样回收实验，按表1分别精密量取3组合煎样品液和不同标准品加入5 mL容量瓶中，每组3份，用甲醇定容于至刻度线，分别精密吸取各样品溶液20 μL,注入液相色谱仪测定含量，平均回收率从高到低依次为阿魏酸、5-羟甲基糠醛，毛蕊花糖苷，回收率良好。见表1。

表1 加样回收率实验

2.10 样品中5-羟甲基糠醛、阿魏酸和毛蕊花糖苷含量测定 吸取供试品溶液至进样瓶，设定进样量为10 μL，进样、测定。见表2、图1。

表2 不同剂型中指标成分含量测定(n=3)

图1 不同剂型中指标成分含量测定

3 讨论

随着中药免煎颗粒剂药效学逐渐被肯定以及在临床上的大量应用，其质量控制成为当前面临的主要问题。本研究比较了四物汤颗粒剂、配方颗粒剂和传统汤剂中5-羟甲基糠醛、阿魏酸、毛蕊花糖苷的含量，所用药材均为同一批次药材，以排除由于药材不均一对结果的影响。考察时按照相对应处方量制成，更接近临床用药形式，与传统汤剂比较也可以消除由于溶剂的改变而造成的差异。在确保原料、工艺及规格一致的情况下建立的特征图谱，能有效地控制中药配方颗粒的质量[10-13]。

本研究制得的四物汤颗粒剂、配方颗粒剂及传统汤剂的平均质量浓度之和分别为19.42、16.00、11.95 mg·ml-1，四物汤颗粒剂是传统汤剂的1.6倍，而配方颗粒剂是传统汤剂的1.3倍，说明不同制备方法对总体含量影响较大，主要原因是饮片汤剂采用传统煎煮制备法，受到煎煮时间、次数、加水量、对火候控制等诸多因素影响，导致其有效成分溶出量受其影响波动较大，而四物汤颗粒剂在制备时提取工艺经过优选，主要成分转移率高，所以含量略高，且保证了药品质量的稳定性[14]。与其他文献[10]只作两种剂型比较，本研究将四物汤颗粒剂、配方颗粒剂及传统汤剂三种剂型放在同一条件下比较，更能突出新剂型改变的优势，为临床应用提供更多的理论依据。

四物汤为中药复方，其按照中医功效协同作用发挥疗效，个别化学成分含量指标仍较难显示其质量优劣，必须再结合药理药效学实验和临床应用研究才能进行全面系统的比较[15-17]。王今凤等[18]对中药配方颗粒的药效学进行综述，发现中药配方颗粒具有某种有效药理效应，并且在某些药理作用上代替传统饮片是可行的。本研究对四物汤颗粒剂、配方颗粒剂与传统汤剂的质量是否一致的问题进行了研究，为这些剂型在临床上的使用提供了依据，具有较强的临床实际指导意义，同时也为四物汤颗粒剂、配方颗粒剂的进一步开发和改进提供了较好的数据和参考。