合肥地区无偿献血人群CD36抗原缺失的调查*

赵娜娜 王超 金惠新 赵阳 吕蓉

CD36抗原又称为GPⅣ、GPⅢb、PASⅣ或FAT，是一种80KD大小的膜糖蛋白，广泛存在于血小板、免疫细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肠细胞、肠内分泌细胞、视网膜和乳腺上皮细胞以及微血管内皮细胞上[1]。研究表明，CD36抗原缺失患者因输血、移植、妊娠等免疫刺激而产生CD36同种抗体，可引起血小板输注无效[2]、新生儿同种免疫性血小板减少症[3]、输血后紫癜[4]等。CD36是胞外基质蛋白凝血酶敏感蛋白的受体，凝血酶敏感蛋白与血小板上的CD36 C-末端区域结合，能促进血小板的黏附。产生CD36抗体的患者，其血小板与胶原蛋白的黏附力下降，并且血小板CD36抗体能抑制血小板变形、聚集和分泌[5]。这些将会导致血小板的黏附、聚集和分泌功能下降，是导致血小板输注无效（PTR）的次要原因。1989年IKEDA等[6]在一位日本血小板输注无效患者体内发现NaKa抗体，并证实NaKa抗原位于CD36分子上，此后发现血小板CD36抗原缺失与血小板输注无效有关。近几年，国内外报道CD36抗体导致的血小板输注无效病例增加，CD36抗原缺失已引起输血界的高度关注。本研究建立了血小板CD36抗原流式检测方法，并分析了合肥地区无偿献血者CD36抗原的缺失频率，现将结果报告如下。

材料与方法

1 研究对象 随机选取合肥地区2020年3月～2020年7月无偿捐献血小板献血者共973例，年龄18～55岁。获得知情同意后采集EDTA抗凝全血2 mL（4 ℃保存），于样本采集24 h内完成CD36抗原的流式检测。

2 主要试剂与仪器 FITC荧光标记抗人CD36单克隆抗体（购自法国Beckman CouLter公司，批号：200012），FITC荧光标记抗人IgG1单克隆抗体（购自法国Beckman CouLter公司，批号：200069），PE荧光标记抗人CD14单克隆抗体（购自法国Beckman CouLter公司，批号：200042），DPBS basic（1X）（赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号：8119439），EDTA/DPBS缓冲液（10 mmol/L EDTA溶于DPBS溶液，pH7.0～7.2），离心机（赛默飞世尔科技有限公司），混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），BD管（FALCON），流式细胞仪（BD FACS Calibur，美国BD公司）。

3 方法

3.1 血小板CD36抗原流式方法检测：取2 mL EDTA抗凝全血，混匀，100 g离心15 min分离上层富含血小板血浆（PRP），用3 mL EDTA/DPBS缓冲液洗涤，3 000 r/min离心5 min，洗涤2次后弃上清，再用EDTA/DPBS缓冲液将血小板稀释至3.0×105/μL。取50 μL稀释后的血小板悬浮液，加入2.5 μL FITC荧光标记抗人CD36单克隆抗体，对照管加FITC荧光标记抗人IgG1单克隆抗体，混匀，室温、避光孵育30 min，用2 mL EDTA/DPBS缓冲液洗涤，2 500 r/min离心3 min，洗涤2次后弃上清，将标记的血小板悬浮在300 μL EDTA/DPBS缓冲液中，混匀，流式细胞仪检测，通过FSC/SSC设血小板门，分析血小板表面的几何平均荧光强度（geometric mean fluorescence intensity，GMFI）。血小板CD36抗原阴性、阳性结果判断：当样本的M1＜5%时（此时M2＞95%,因为M1+M2=100%）判定该样本为阴性；当样本的M1＞5%时（此时M2＜5%）判定该样本为阳性。

3.2 单核细胞CD36抗原流式方法检测：取100 μL EDTA抗凝血，加入5 μL FITC标记抗人CD36单克隆抗体、5 μL PE标记抗人CD14单克隆抗体，混匀，避光、室温孵育20 min后，再加入500 μL红细胞裂解液，混匀，避光、室温静置15 min，加入2 mL～3 mL DPBS缓冲液洗涤，3 000 r/min离心5 min，弃上清（重复一次），再用500 μL DPBS缓冲液重悬细胞扣，混匀，流式细胞仪分析。 单核细胞CD36抗原阴性、阳性结果判断：当样本的M2＜5%时（此时M1＞95%，因为M1+M2=100%）判定该样本为阴性；当样本的M2＞5%时（此时M1＜5%）判定该样本为阳性。

3.3 CD36抗原缺失分类的定义：流式细胞仪检测献血者血小板CD36抗原阴性后，对献血者单核细胞进行检测CD36抗原。若单核细胞CD36抗原为阴性，则该献血者为CD36Ⅰ型缺失；若单核细胞CD36抗原为阳性，则该献血者为CD36Ⅱ型缺失。

结 果

1 973例合肥地区无偿献血者CD36抗原检测情况 血小板CD36抗原流式检测和单核细胞CD36抗原流式检测示意图见图1和图2。共检出血小板CD36抗原阳性者957例，血小板CD36抗原缺失者16例，缺失频率为1.64%；其中Ⅰ型缺失2例，Ⅱ型缺失14例，缺失频率分别为0.20%（2/973）和1.44%（14/973）。在血小板CD36抗原缺失者中，Ⅰ型缺失占12.50%（2/16）、Ⅱ型缺失占87.50%（14/16），CD36抗原检测结果及分布情况（见表1）。

表1 CD36抗原的表达与分布情况

2 人群血小板CD36抗原表达差异 根据血小板上CD36抗原的几何平均荧光强度GMFI发现，合肥地区无偿献血者血小板CD36抗原表达强度存在差异：16例CD36表达阴性（缺陷型），GMFI值为32.25±5.31；957例CD36表达阳性（非缺陷性），其中CD36抗原低表达有128例，其GMFI为165.57±27.76，CD36抗原中表达有686例，其GMFI为346.88±88.81，CD36抗原高表达有143例，其GMFI为 659.05±111.18。

图1 血小板CD36 抗原流式表达示意图

图2 单核细胞CD36 抗原流式表达示意图

讨 论

随着临床血小板输注量的增多，发现CD36抗原缺失者经输血、妊娠、移植等途径带来的免疫刺激后易产生抗CD36抗体，后者可导致血小板输注无效、新生儿同种免疫血小板减少、输血后紫癜等疾病，因此CD36抗原-抗体相关研究越来越被重视，已有的研究发现CD36缺失型在中国人群中占有相当比例[7]。CD36抗原缺失分为2种类型：Ⅰ型为血小板和单核细胞都不表达CD36抗原；Ⅱ型仅是血小板缺失CD36抗原，而单核细胞上表达CD36抗原[8]。Ⅱ型缺失又被分为2个亚类，2a和2b，只是血小板缺乏CD36为2a；如果红细胞也缺乏CD36，为2b[9]。Ⅱ型比Ⅰ型更常见。研究证实CD36缺失Ⅰ型的分子机制主要源于编码区的基因突变[10]；Ⅱ型缺失的分子机制目前尚不明确。KASHIWAGI等[11]推测在CD36基因上或其附近存在一个“血小板特异性沉默等位基因”，该基因会影响CD36的表达。IMAI等[12]假设存在血小板限制调节因子，其导致CD36抗原Ⅱ型缺失，而XU等[13]研究发现起始密码子上游的基因突变会导致CD36抗原表达低下，因此认为在5´-UTR存在几个潜在的顺式调控元件对转录进行调控，最终导致血小板CD36抗原Ⅱ型缺失。也有研究发现有些CD36基因突变并不一定会引起CD36抗原缺失，有的只是会引起抗原表达量减少，甚至没有影响[14]。

本次研究分析了合肥地区人群CD36抗原缺失频率，在检测的无偿献血者CD36抗原缺失频率为1.64%。据报道非洲人缺失率较高，美国非裔为2.4%[15]，亚洲人群缺失率为5%～10%[1]，日本为3%～11%[16]，白种人缺失率仅为0%～0.3%[4]；国内报道的CD36缺失分别为广州2.10%[17]、深圳3.19%[18]、 长 春 3.45%[19]、 广 西 4.13%[20]、 杭 州3.6%[13]，其中广西壮族人群高达5.76%。由此可见，CD36抗原缺失率存在地区和种族差异，合肥地区缺失频率较中国南部地区CD36缺失率略低。

目前多用流式细胞法检测血小板CD36抗原，根据细胞在流式细胞仪上的前向角和侧向角确定血小板区域，排除红细胞、白细胞和碎片的干扰，并分析血小板区域的荧光强度。从本次结果分析，CD36抗原缺失者中A、B、O、AB血型个数均不低于2个，可为临床输注CD36抗原阴性血液患者提供帮助，也可为建立合肥地区无偿献血人群CD36抗原表达阴性资料库的建立打下基础。

本研究建立了血小板和单核细胞的CD36抗原流式检测方法，并初步分析了合肥地区CD36抗原缺失频率。血小板CD36抗原流式检测方法的建立可用于对无偿献血者CD36抗原筛查及临床病人血小板CD36抗原检测，为血小板输注无效并产生CD36抗体的患者寻找CD36抗原阴性血液制品提供基础，但是本研究只进行了CD36抗原的调查，而缺失的分子机制还待进一步研究探讨。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突