不同来源复水液对冻干PRP活化和释放生长因子影响的比较*

林放 周谋 单桂秋 李艳辉 李文丹

富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是全血经离心后得到的一种血小板浓缩物，其中含丰富的生长因子，在促进创面愈合和抑菌抗炎中发挥着重要的作用。由于PRP的保存时间短，受环境因素影响容易被激活或污染，降低了其应用价值。

对PRP进行冻干，能使PRP在常温条件下保存，所占空间小，还便于运输。冻干PRP一般用贫血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）进行复水化[1-3]，但使用前需要分离制备PPP，不仅操作繁琐，对制备环境要求高，还有患血液传染病的风险。为了让冻干PRP复水化的步骤变得更简便、安全，本实验研究了不同成分的复水液，并对复水化后的冻干PRP活化和释放生长因子效果进行比较。现将研究结果报告如下。

材料与方法

1 试剂和仪器

1.1 试剂：TGF-β1 ELISA试剂盒（RayBio，批号0615180188）、VEGF-A ELISA试剂盒（RayBio，批号0504180196）、PDGF-BB ELISA试剂盒（RayBio，批号0615180180）、bFGF ELISA试剂盒（RayBio，批号0608180107）、P-Selectin（RayBio，批号1026180217）、CD63（RayBio，批号1214182471）、生理盐水（医院自制，批号18041122）、PBS缓冲液（Thermo Fisher Scientific，批号8118177）、血细胞分析仪用溶血剂（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，批号2017122401）、血细胞分析用稀释液（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，批号2018033102）等。

1.2 仪器：酶标仪（赛默飞世尔（上海）仪器有限公司，型号Multiskan Mk3）、血细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号BC-3000 plue）、超纯水机（广州誉维生物科技仪器有限公司，型号Unique-S）、真空冷冻干燥机（德国Christ公司，型号Alpha1-4lsc Plus）等。

1.3 富血小板血浆来源：来自2018年8月在南部战区总医院血液中心献血的健康无偿献血者，献血前3日未服用阿司匹林或阿司匹林类药物，并进行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP等输血相关性传染病检测。用ACD五联血小板采集袋采集8人份O型全血（400 mL），汇集成1份血小板，6 h内采用白膜法制备浓缩血小板，并调节汇集血小板计数至800×109/L，（22±2）℃振荡摇床过夜，使其解聚。

2 方法

2.1 血小板冻干预处理液的配制：精确称量NaCl 3.214 g，KCl 0.157 g，CaCl20.078 g，MgSO40.271 g，NaHCO32.604 g，柠檬酸 0.714 g，柠檬酸钠1.970 g，乙酸钠1.230 g，葡萄糖2.120 g，海藻糖17.117 g，用超纯水溶解，定容至1 L。加入1 μl/mL可逆性血小板激活抑制剂PGE1，调节pH至6.6～6.8，0.22 μm滤器过滤。

2.2 冻干缓冲液配制：在上述血小板冻干预处理液中加入30%蛋白质类保护剂，3 000 r/min离心20 min，移出上清，调pH为6.6～6.8，0.22 μm滤器过滤。

2.3 血小板冻干前预处理：将汇集血小板，3 000 r/min离心20 min，移上清留沉淀，用与移去上清同体积的预处理液重悬血小板，37℃振荡水浴4 h，使血小板保持悬浮状态。水浴后，将血小板悬液再以3 000 r/min离心20 min，弃上清留沉淀，用与弃去上清同体积的冻干缓冲液重悬血小板。

2.4 血小板悬液冻干：将预处理后血小板悬液转移到冻干瓶（硅化玻璃瓶）中，每瓶4 mL（厚度不超过1.5 cm），置于-80℃超低温冰箱中预冻过夜，次日先将冻干机打开，使冷阱温度降至-46℃后，将冻干样品从冰箱取出移入冻干机并开始进行真空干燥，保持真空度为＜133 mbar，真空干燥24 h后取出，密封后置于室温干燥处保存。

2.5 冻干PRP复水化及激活：按复水液的种类，将实验分成生理盐水组、超纯水组和PBS缓冲液组，将PPP复水液设为对照组。冻干PRP分别用4 mL的PPP、生理盐水、蒸馏水和PBS缓冲液进行一步法复水，使其体积与冻干保存前血小板悬液相同体积，轻轻振荡摇匀至冻干粉完全溶解。

冻干PRP完全复水化，将200 U凝血酶冻干粉溶于2 mL的葡萄糖酸钙注射液中，置37℃水浴30 min，充分激活后以3000 r/min离心20 min，分装上清至EP管中待检[4，5]。

2.6 复水后PRP凝血功能和生长因子含量检测：按照分组，对冻干PRP进行复水化，并用ELISA法检测复水后PRP中P-Selectin（P-选择素）、CD63、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor VEGF）、胰岛素样生长因子I（insulin-like growth factor-I，IGF-I）、碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、转化生长因子β（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的含量，具体实验步骤参照试剂盒提供的说明书进行操作。

3 统计学处理 各组别的比较，采用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），当方差齐时，进一步采用LSD分析结果，当方差不齐时，Dunnett T3分析结果，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 复水后PRP理化性质检测结果 由图1可见，PPP、生理盐水和PBS缓冲液可以将冻干PRP复水化成液体，但用超纯水复水化的冻干PRP有较多絮状物，离心后立即凝集成凝胶。

2 复水后PRP凝血功能和生长因子含量检测结果 各组冻干PRP复水后，我们用ELISA法检测了P-Selectin、CD63、PDGF-BB、TGF-β1、VEGF、EGF、IGF-I 及FGF-b的含量。由表1可知：P-Selectin、VEGF-A含量：生理盐水组、超纯水组和PBS缓冲液组均高于PPP组，差异无统计学意义（P＞0.05）。CD63含量：生理盐水组高于PPP组，超纯水组和PBS缓冲液组均低于PPP组，差异无统计学意义（P＞0.05）。IGF-I含量：生理盐水组、超纯水组和PBS缓冲液组均低于PPP组，差异有统计学意义（P＜0.05）。bFGF、PDGF-BB、TGF-1β含量：生理盐水组、超纯水组和PBS缓冲液组均低于PPP组，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 冻干PRP复水化后外观

表1 各组冻干PRP复水化后生长因子含量

讨 论

PRP对急、慢性创面都有良好的促进愈合和抗感染功能，在临床上广泛使用。PRP制备后，需立即使用，且无法长期保存，因此在临床推广受到了一定的限制，将血小板进行冻干，可解决血小板只能短期保存的缺点[6]。冻干后的血小板，常温下可长期保存，质量轻，方便携带，需要时使用复水液进行复水化，即可使用。本实验为了进一步验证PRP冻干后的效果，使用的是一年前冻干并常温保存的冻干PRP。

贫血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）是目前普遍使用的冻干PRP复水液[7-10]，使用前需要分离制备，血浆有污染的风险，因此对制备环境要求较高，加上血液有窗口期，使用PPP进行复水化，也增加了患血液传染病的风险。生理盐水是一种生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压基本相等的氯化钠溶液；超纯水是蒸馏、去离子化、反渗透技术生产出来的水，无矿物质微量元素和细菌、病毒、含氯二噁英等有机物；PBS缓冲液是一种磷酸盐缓冲液，起溶解保护试剂的作用，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl[11]。虽然临床上已经通过实验证实PPP做为复水液，血小板的回收率最高[12]，但以上三种溶液和PPP相比，有来源安全、没有血液传染病和使用时不需制备等优点。为此，本实验将生理盐水、超纯水和PBS缓冲液作为冻干PRP的复水液，并以PPP作为对照，探讨用其他溶液代替PPP作为冻干PRP复水液的可靠性。

P-Selectin是血小板活化的特异性标志物[13]，CD63是活化血小板表面的抗体，反映体内血小板活化程度[14]，这两个指标都与相应血小板体内存活率和存活期呈负相关[15]。为此，我们选择了其作为检测复水化后血小板功能的检测指标，探讨不同复水液对血小板凝血功能的影响。本实验的检测结果显示，生理盐水、超纯水和PBS缓冲液作为复水液，P-Selectin和CD63的数值稍高于PPP，但无统计学差异。这说明这三种复水液在复水化的过程中，血小板被激活的程度略高于PPP，但在血小板的聚集反应和促凝血活性功能上与使用PPP复水后无差异。

VEGF-A、IGF-1、bFGF、PDGF-BB、TGF-1β这五种生长因子是PRP中含量较高的生长因子，为此我们将其作为检测指标，探讨各种复水液对释放生长因子效果的影响。本实验的检测结果显示，三种复水液的生长因子含量均低于PPP组，除IGF-I含量差异有统计学意义外，其余四种生长因子的含量与PPP组相比均无统计学意义。这说明，这三种复水液的释放生长因子效果并不差于PPP，更不影响冻干PRP在后续使用时，促进细胞增殖、血管形成和细胞外基质沉积的作用。但我们在实验中发现，超纯水作为复水液，会迅速激活冻干PRP中的血小板，使复水化后的PRP形成了凝胶状，无法进行下一步的制备或注射，其原因还需进一步研究。

从上述的结果我们初步可知，生理盐水、超纯水和PBS缓冲液作为冻干PRP的复水液，在凝血和促进创面愈合的功能上，并不差于PPP，均可替代PPP。但超纯水会将冻干PRP复水化成凝胶，因此本实验初步确定生理盐水和PBS缓冲液都是冻干PRP的较理想的复水液，但对血小板功能活性的影响还需要进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突