藏药四臣止咳颗粒的指纹图谱研究

覃柳莹，蔡梦如，姚宇，白杰，吴慧敏，张志勤，张硕峰，倪健，格桑顿珠，尹兴斌*

（1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.西藏藏医药大学，拉萨 850000）

藏药四臣止咳颗粒来源于藏医理论经典古方加之名老藏医药专家多年经验方而成，由螃蟹甲、猪毛蒿、甘草、岩白菜4 味药组成，具有清热解毒、止咳化痰的功效。方中甘草的甘草酸、甘草次酸等活性成分具有抗病毒、抗炎杀菌的作用[1]；猪毛蒿中的绿原酸等有机酸类成分是抗菌、抗病毒的主要活性成分[2]；螃蟹甲的总皂苷类成分有镇咳、祛痰、平喘的作用[3]；岩白菜中的岩白菜素具有极强的止咳作用[4]。研究表明，四臣止咳颗粒对浓氨水、二氧化硫、枸橼酸等对呼吸道刺激引起的咳嗽有显著的抑制作用，亦能抑制二甲苯、角叉菜胶诱发的急性炎症[5]。目前关于四臣止咳颗粒的研究多为制备工艺优化及药效作用评价[6-8]，关于其质量控制研究较少。中药复方具有化学成分复杂、多靶点的特点，药效作用的发挥往往是多种成分共同作用的结果，因此对其质量控制需要更全面的评价方法。指纹图谱具有整体性和模糊性的特点，能够充分整合并反映中药复方的化学成分信息，是中药复方制剂质量标准全面评价研究的重要方法[9]。因此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）建立了四臣止咳颗粒的指纹图谱，通过多成分控制产品质量，确保产品的安全有效[10]。

1 仪器与试药

MS105 DU 型电子分析天平（Mettler-Toledo GmbH）；YP 5002 型电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；SB-5200 DTD 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SPD-M20A 型高效液相色谱仪（岛津）。

甘草苷（批号：111610-201607， 纯度：93.1%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，纯度：96.2%）、绿原酸（批号：110753-201817，纯度：96.8%）、岩白菜素（批号：111532-201604，纯度：94.1%）、熊果苷（批号：111951-201301，纯度：99.7%）、没食子酸（批号：110831-201906，纯度：91.5%）对照品（中国食品药品检定研究院）；隐绿原酸（批号：B21587，纯度≥98%）、8-O-乙酰山栀苷甲酯（批号：B21858，纯度≥98%）对照品（上海源叶生物科技有限公司）；甘草（批号：20180928，本草方源有限公司），岩白菜、猪毛蒿、螃蟹甲均由西藏藏医药大学提供，3 种药材由格桑顿珠副教授分别鉴定为虎耳草科植物岩白菜的干燥根茎、菊科植物滨蒿的干燥地上部分及唇形科植物螃蟹甲的干燥块根。11 批四臣止咳颗粒样品为自制样品，由不同批次提取制备的干膏粉与糊精经不同操作人员进行湿法制粒而成（编号：S1 ～S11）。

后期时，因经历与北方异族作战，盟中人数骤然减少，风气也更为自由。盟主时常一年轮换一次，也不必特意召开比武大会。而是由现任盟主与选好的下任盟主对打一次，仪式性居多，其结果必定是现任盟主（或真或假的）落败，随后新任盟主上任。

2 方法结果

2.1 色谱条件

Thermo Acclaim 120 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～16 min，4%～8%A；16 ～30 min，8% ～9%A；30 ～50 min，9% ～16%A；50 ～70 min，16% ～17%A；70 ～73 min，17% ～20%A；73 ～93 min，20% ～28%A；93 ～105 min，28% ～43%A；105 ～120 min，43%～50%A），流速0.8 mL·min－1，检测波长254 nm，柱温20℃，进样量10 μL。

2.3.3 稳定性试验 取样品S1，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 进样，记录色谱图，以7 号峰为参照，经计算各共有峰的相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于5%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.2 重复性试验 取样品S1，按“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，以7 号峰为参照，经计算各共有峰的相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于5%，表明方法重复性良好。

2.2 溶液制备

2.2.2 混合对照品溶液 精密称定甘草苷、甘草酸铵、绿原酸、隐绿原酸、山栀苷甲酯、岩白菜素、熊果苷、没食子酸对照品适量，加50%甲醇制成含甘草苷48.41 μg·mL－1、甘草酸铵31.75 μg·mL－1、岩白菜素88.45 μg·mL－1、绿原酸44.53 μg·mL－1、熊果苷103.69 μg·mL－1、没食子酸57.65 μg·mL－1、隐绿原酸60.76 μg·mL－1、8-O-乙酰山栀苷甲酯43.12 μg·mL－1的混合对照品溶液。

2.2.1 供试品溶液 取本品适量，研细，取约0.6 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入50%甲醇30 mL，40 kHz 超声提取30 min，放冷，加50%甲醇补足失重，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

一位社工负责全职照看结核病人的工作，在结核病房工作的其他社工负责把所有的结核病人都转介给她。她参加结核病门诊，查看所有由医生转介的结核病人，并尽力安排他们去门诊治疗，或是住院，或是住疗养院，或是回家休养。无论如何，治疗都是合理的。结核病人所需的治疗方式，是医生和社工根据对患者的病情、社会和经济状况的慎重考虑而共同决定的。服务重点是照顾处于早期阶段的结核病患者，以及有足够收入以完成整个治疗过程的病人。

James说在后期需要进行适当调整。“用Lightroom适当提升清晰度，给图像带来了冲击力。用Photoshop对边缘地区进行选择性模糊处理，可让观众的注意力从彩色涂鸦转移到路虎卫士车头的格栅设计上。”

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取样品S1，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图。以峰面积较大，分离度好的7 号峰为参照，经计算各共有峰的相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 阴性样品溶液 按处方比例分别称取各味药阴性提取物粉末，精密称定，按“2.2.1”项下方法制备，即得。

综上所述，糖尿病对心肌不同时间点上时Bmal1、Per2的表达产生影响，糖尿病病理状态使时钟基因昼夜表达节律发生异常，其可能是糖尿病心肌损伤的重要内源性机制。

两种焊接工艺焊缝的金相组织如图7a所示，其中间部分是针状铁素体，周围是晶界铁素体。自动焊焊缝中的组织比手工焊分布更加均匀，晶粒更加细小。

2.2.3 单味药供试品溶液 按处方比例分别称取各单味药提取物及各单味药饮片粉末，精密称定，按“2.2.1”项下方法制备，即得。

2.4 指纹图谱的建立

取11 批（S1 ～S11）颗粒样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。将得到的S1 ～S11 图谱导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》进行分析，以S1 图谱作为参照，采用中位数法，时间窗宽度为0.3 min，经多点校正后全峰谱匹配，生成对照指纹图谱，见图1。根据所检测的图谱，选择稳定性好、吸收较强、特征明显的色谱峰作为共有峰进行标定，确定了25 个共有峰，选择峰面积较大、分离度较好的7 号峰作为参照峰。11 批四臣止咳颗粒指纹图谱见图2。

图1 四臣止咳颗粒对照指纹图谱Fig 1 HPLC reference fingerprint of Sichen Zhike granules

图2 11 批四臣止咳颗粒样品的HPLC 指纹图谱Fig 2 HPLC fingerprint of 11 batches of Sichen Zhike granules

2.5 共有峰的归属与指认

分别取各单味药供试品溶液及阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录色谱图（见图3 ～6）。结果显示，5、7、8、11、16、17、18、19 号峰来源于猪毛蒿，1、3、6、13 号峰来源于岩白菜，9、12、14 号峰来源于螃蟹甲，15、20、21、22、23、24、25 号峰来源于甘草，其中2 号峰共同来源于猪毛蒿和甘草，4 号峰共同来源于猪毛蒿、岩白菜和螃蟹甲，10 号峰共同来源于猪毛蒿、岩白菜和甘草。通过与对照品进行比对，共指认8 个指标成分，1 号峰为熊果苷、3 号峰为没食子酸、6 号峰为岩白菜素、7 号峰为绿原酸、8 号峰为隐绿原酸、12 号峰为8-O-乙酰山栀苷甲酯、15 号峰为甘草苷、24 号峰为甘草酸铵，见图7。

图3 猪毛蒿单味药、阴性样品溶液与供试品溶液HPLC 指纹图谱Fig 3 HPLC fingerprint of single medicine of Artemisia scoparia，negative solution and sample solution

图4 岩白菜单味药、阴性样品溶液与供试品溶液HPLC 指纹图谱Fig 4 HPLC fingerprint of single medicine of Bergenia purpurascens，negative solution and sample solution

图5 螃蟹甲单味药、阴性样品溶液与供试品溶液HPLC 指纹图谱Fig 5 HPLC fingerprint of single medicine of Phlomis younghusbandii，negative solution and sample solution

图6 甘草单味药、阴性样品溶液与供试品溶液HPLC 指纹图谱Fig 6 HPLC fingerprint of single medicine of Glycyrrhiza uralensis，negative solution and sample solution

2.6 相似度分析

图7 混合对照品溶液与供试品溶液HPLC 指纹图谱Fig 7 HPLC fingerprint of mixed reference substances and sample solution

对11 批样品指纹图谱进行相似度分析，结果表明11 批样品指纹图谱与对照图谱的相似度均≥0.99，各批次间样品相似度均＞0.97，见表1。说明四臣止咳颗粒制剂工艺稳定，不同批次间化学成分组成差异较小，质量稳定。

2.7 化学模式识别

2.7.1 聚类分析 运用SPSS 统计软件进行分析，以25 个共有色谱峰的峰面积数据为变量，Z 标准化，以平方Euclidean 距离为度量标准，采用Ward 法对11 批四臣止咳颗粒进行系统聚类，见图8。结果显示，类间距为10～25时可分为两类，聚类结果与相似度结果相符，表明四臣止咳颗粒的制剂工艺较为稳定，各批次间差异较小。

表1 11 批四臣止咳颗粒相似度评价结果表Tab 1 Similarity evaluation of HPLC fingerprint for 11 batches of Sichen Zhike granules

图8 11 批四臣止咳颗粒样品聚类分析树状图Fig 8 Dendrogram of clustering analysis of 11 batches of Sichen Zhike granules

2.7.2 主成分分析 运用SAS 8.2 软件分析，以25 个共有峰峰面积为变量，特征根＞1 为标准，提取到5 个主成分，累积贡献率为93.100%，见表2。根据主成分载荷矩阵，见表3，确定第一主成分中载荷量较大的7 个变量，分别为15、12、6、7、22、24、1 号峰，表明第一主成分主要反映了这些成分的信息，其中15 号峰为甘草苷，12 号峰为8-O-乙酰山栀苷甲酯，6 号峰为岩白菜素，7 号峰为绿原酸，24 号峰为甘草酸铵，1 号峰为熊果苷；同理，第二主成分主要反映了18、5、8、2、20、16 号峰的信息，其中8 号峰为隐绿原酸；第三主成分主要反映了21、25、3、14、9、13、11、17、19 号峰的信息，其中3 号峰为没食子酸。以5 个主成分（Z1～Z5）所对应的方差贡献率占所提取主成分的累积贡献率的比例作为权重（即各主成分系数＝各主成分方差贡献率/5 个主成分累计贡献率），计算主成分综合模型为：Y＝0.3770Z1＋0.3188Z2＋0.1696Z3＋0.0844Z4＋0.0502Z5，通过模型计算各样本综合得分并进行排序，初步对11 批样品进行优劣分析，综合得分（Y）高为好，11 批样品中以S2 批次为最优。同时，可通过各批次的各主成分得分比较分析各批次间的主要成分差异，结果见表4。

表2 11 批四臣止咳颗粒样品指纹图谱共有峰主成分分析结果Tab 2 Principal component analysis of common peaks in fingerprints of 11 batches of Sichen Zhike granule

表3 11 批四臣止咳颗粒样品指纹图谱共有峰主成分载荷矩阵Tab 3 Principal component loading matrix of common peaks in fingerprints of 11 batches of Sichen Zhike granule

3 讨论与结论

研究考察了以甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水系统对指纹图谱的分离情况，以乙腈-0.1%磷酸水系统分离情况最佳，峰形较好。分别考察了50%甲醇在30、45、60 min 超声提取时间对提取效果的影响，结果在45 min 及60 min 时提取峰数量及峰面积并未有显著增加，故选择50%甲醇超声30 min 提取。同时比较了流速在0.6、0.8、1.0 mL·min－1时的分离情况，结果在0.8 mL·min－1时色谱峰分离情况较好。通过DAD 检测器在190 ～400 nm 进行全波长扫描，在254 nm 波长处色谱峰较多，可代表的信息较全面，因此选择254 nm 作为指纹图谱的采集波长。

表4 11 批四臣止咳颗粒样品主成分得分及综合得分排序Tab 4 Principal component score and comprehensive score ranking of 11 batches of Sichen Zhike granule

在指纹图谱测定过程中，通过对比生药材与提取物的指纹图谱发现，猪毛蒿生药中绿原酸含量较高，隐绿原酸含量很低，而经过工艺提取后，绿原酸含量降低，隐绿原酸含量大幅升高。猪毛蒿中主要含有以绿原酸为代表的酚酸类成分，通过查阅文献可知，绿原酸在提取过程中因受热水解可转化为新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸等衍生物[11]。因此，在四臣止咳颗粒的生产及质量控制中，可重点关注水溶性酚酸类成分的变化，能够更全面地控制产品质量。

本研究首次建立了四臣止咳颗粒HPLC 指纹图谱，标定25 个共有峰，指认8 个色谱峰。该方法稳定性、精密度、重复性良好。采用指纹图谱相似度评价软件对不同批次四臣止咳颗粒进行相似度评价，结果不同批次四臣止咳颗粒化学成分组成上差异较小，质量较稳定。化学模式识别是化学计量学的重要组成部分，也是筛选中药质量标志物的重要方法，在中药的质量控制与评价研究中具有重要意义[12]。研究采用统计软件对11批颗粒样品进行系统聚类和主成分分析，结果将样品聚为两类，提取出5 个主成分，累计贡献率为93.100%，已指认成分有甘草苷、8-O-乙酰山栀苷甲酯、岩白菜素、绿原酸、甘草酸铵、熊果苷、隐绿原酸、没食子酸。本研究结果可为四臣止咳颗粒的质量控制提供更全面的参考。