血清miR-150、miR-21和NLR早期诊断妊娠期糖尿病肾功能损害的临床价值

陈艳华 谢旭雯

妊娠期糖尿病(GDM)指妊娠期间发生糖代谢异常，是妊娠期常见并发症，肾损害是GDM的严重并发症之一，对孕妇和围产儿造成严重影响，甚至危及生命[1,2]。肾损伤早期常常不明显，当肾功能已经处于明显损伤时，对患者来说失去了最佳的治疗时机。中性粒细胞/淋巴细胞比率(NLR)是一种炎症性指标，在冠心病，GDM等疾病中的诊断价值引起了广泛的关注，在GDM肾损害诊断方面尚未见报道[3]。微小RNA(miRNA)是一种非编码的RNA，在基因的转录水平进行调控，在妊娠期间母体血液中检测到大量与GDM相关的miRNA，由胎盘分泌，随着妊娠期胎盘生长，参与了GDM的病理生理过程[4,5]。本组研究通过检测GDM患者血清miR-150、miR-21和NLR水平，观察其在诊断GDM早期肾功能损伤的临床价值，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年1月至2019年6月在我院就诊的GDM患者88例为GDM组，年龄21～40岁，平均(27.64±5.61)岁；孕周22～38周，平均(26.38±6.19)周。根据24 h蛋白尿排泄率分为单纯GDM肾病(<31 mg/24 h)34例，早期GDM(31～299 mg/24 h)29例和临床GDM肾病(>300 mg/24 h)25例；根据糖化血红蛋白水平分为<8.0%为37例，8.0%～9.0%为29例和>9.0%为22例；根据肾病的肾小球滤过率严重程度分为轻度(>60 ml/min)19例，中度(30～60 ml/min)15例和重度(<30 ml/min)20例。选择同期在我院诊断为糖耐量异常的孕妇30例为糖耐量异常组，年龄21～40岁，平均年龄(27.19±6.72)岁；孕周22～38周，平均(26.48±5.27)周。选择同期在我院行健康体检孕妇30例为正常妊娠组，年龄21～40岁，平均年龄(27.79±5.37)岁；孕周22～38周，平均(26.91±5.37)周。3组年龄和孕周等基线资料差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：均签署知情同意书；经医院伦理委员会审核通过。

1.2.2 排除标准：高血压，冠心病，肝脏和肾脏疾病；糖尿病；血液性和肿瘤性疾病；肝炎，结核和肺部感染等急慢性感染。

1.3 方法

1.3.1 血液与尿液标本的检测:患者入院后清晨空腹肘静脉血约10 ml，在4℃的条件下放置30 min，低速离心20 min，离心速度1 800 r/min，离心半径为15 cm，离心后去上清液。另外收集患者早晨中段尿液5 ml，采用3 000 r/min的离心速度，离心10 min，选取上清液，放置在-70℃冰箱待测。尿液ACR使用全自动生化仪采用免疫比浊法进行测定；采用放射免疫法测定β2-微球蛋白(β2-MG)。

1.3.2 miRNA提取和逆转录反应:根据miRNeasy提取试剂盒的说明书提取miRNA，并通过紫外分光度将吸光度的比值在1.8～2.0的标本保存用于后续检测，保存在-70℃的冰箱中。按照miRNA反转录试剂盒的使用说明书将miRNA反转录为cDNA，标本保存在-70℃的冰箱中。

1.3.3 qRT-PCR检测:根据GenBank中的miR-150，miR-21和U6的序列号，并用Premier Primer5.0软件进行引物设计，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成引物。miR-150引物序列，上游： 5’-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3’， miR-21的引物序列，上游：5’-GTGCAGGGT CCGAGGT-3’和U6引物序列，上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物为试剂盒自带。qRT-PCR的总反应体系为25 μl，包括上下游引物各1.0 μl(其浓度为10μmmol/L)，cDNA为0.8 μl，RNaseH2O为12.2 μl和SYBRPPrimix Ex TaqTM 10 ml。反应条件为：预变性温度95℃10 min，95℃和60℃分为5 s和60 s，总共进行40个循环。在60℃下用ABI7700软件收集荧光信号进行溶解曲线分析，每个样品进行3个平行复孔，相对表达量采用表示2-ΔΔCt，公式表达为ΔΔCt=试验组(Ct目标基因-CtU6)-对照组(Ct目标基因-CtU6)。

1.3.4 观察指标:比较GDM组，糖耐量异常组和正常妊娠组血清miR-21，miR-150，NLR和β2-MG水平变化，观察GDM组患者血清miR-21，miR-150，NLR和β2-MG水平与糖尿病严重程度，肾功能损害，肾脏损害严重程度的关系及其在诊断GDM肾功能损害的诊断效能。

2 结果

2.1 3组血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平的变化 GDM组血清miR-21、NLR和β2-MG水平明显高于糖耐量异常组和正常妊娠组(P<0.01)，而糖耐量异常组明显高于正常妊娠组(P<0.01)；GDM组血清miR-150表达明显低于糖耐量异常组和正常妊娠组(P<0.01)，而糖耐量异常组明显低于正常妊娠组(P<0.01)。见表1。

表1 3组血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平的变化

2.2 血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平与GDM糖尿病严重程度的关系 血清miR-21、NLR和β2-MG水平随着糖尿病严重程度升高而升高(P<0.01)，而血清miR-150表达水平随着糖尿病严重程度升高而降低(P<0.01)。见表2。

表2 血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平与GDM糖尿病严重程度的关系

2.3 血清miR-21，miR-150，NLR和β2-MG水平与肾功能损害的关系 血清miR-21，NLR和β2-MG水平随着肾功能损害程度升高而升高(P<0.01)，而血清miR-150表达水平随着肾功能损害程度升高而降低(P<0.01)。见表3。

表3 血清miR-21，miR-150，NLR和β2-MG水平与肾功能损害的关系

2.4 血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平与GDM肾损害严重程度的关系 血清miR-21，NLR和β2-MG水平随着GDM肾损害严重程度升高而升高(P<0.01)，而血清miR-150表达水平随着GDM肾损害严重程度升高而降低(P<0.01)。见表4。

表4 血清miR-21、miR-150、NLR和β2-MG水平与GDM肾损害严重程度的关系

2.5 miR-21，miR-150和NLR水平在预测早期GDM肾病的效能 miR-21(Z=2.339，P<0.05)，miR-150(Z=2.127，P<0.05)和NLR(Z=2.355，P<0.05)水平在预测早期GDM肾病的效能明显优于β2-MG，而miR-21，miR-150和NLR差异无统计学意义(P>0.05)。将miR-21，miR-150和NLR进行二元logistics回归得方程4.181×X miR-21-1.932×XmiR-150+1.94×XNLR-9.966，联合检测在预测GDM肾损伤的灵敏度为96.6%，特异性为97.1%，AUC为0.995明显高于单个指标miR-21(Z=2.461，P<0.05)，miR-150(Z=2.496，P<0.05)和NLR(Z=2.272，P<0.05)的检测。见表5，图1。

图1 miR-21、miR-150和NLR水平在预测早期GDM肾病的效能

表5 miR-21，miR-150和NLR水平在预测早期GDM肾病的效能

3 讨论

GDM是与妊娠相关生理状态，对母婴产生极大的危害，甚至危及生命[6]。本组研究发现GDM组的NLR水平明显高于糖耐量异常组和正常妊娠组，并发现与糖化血红蛋白的水平呈正相关，说明NLR参与了GDM疾病的发生发展过程，并且与患者糖尿病的严重程度相关，与文献报道的结果类似[7]。本组研究还发现临床GDM肾病组的NLR水平明显高于早期GDM肾病组，而早期GDM肾病组又明显高于单纯GDM组，并且发现随着肾病严重程度的升高，孕妇的NLR水平出现明显升高，说明NLR在评价肾脏功能损害方面具有重要的临床意义。现已知NLR是炎症性疾病的重要标记物，是动脉粥样硬化和冠心病严重程度的重要指标，中性粒细胞是先天性的免疫反应，而临床细胞是获得性免疫，2组免疫调控互补，因此为较为全面反应炎症的重要指标[8,9]。现有研究证实慢性亚临床炎症会加重糖尿病胰岛素抵抗，促进其并发症的发生发展[10]。本组研究发现NLR在诊断早期肾病方面具有较高的诊断效能，但NLR>4.21时，其灵敏度为93.1%，特异性为70.6%，AUC为0.912明显高于β2-MG，说明NLR在诊断早期GDM肾病的诊断方面具有重要临床意义。

miRNAs参与了妊娠的发生发展过程，随着胎盘的肾脏，其miRNAs表达水平和类型出现明显变化。同时在糖尿病肾病的研究中发现miRNAs参与了其发生发展的病理生理过程[11,12]。本组研究发现血清miR-21表达GDM组明显高于糖耐量异常组和正常妊娠组，并且随着GDM糖尿病严重程度升高而升高，临床GDM肾病组明显高于早期GDM肾病和单纯GDM组，说明miR-21参与了GDM肾病的发生发展过程。miR-21定位于17号染色体q23.2上，并发现在糖尿病及其并发症的发生发展具有密切关系[13]。一项糖尿病的研究中发现miR-21表达水平是2型糖尿病合并冠心病的独立危险因素，与血脂水平呈正相关[14]。本组研究发现血清miR-21表达水平随着肾病严重程度的升高而升高，与文献报道的结果[15]一致。本组研究发现血清miR-21表达水平在诊断早期GDM肾病具有较高的特异性，当血清miR-21表达水平>2.14时，其灵敏度为82.8%，特异性85.3%，AUC为0.906明显高于β2-MG，说明在诊断早期GDM肾病具有较高的诊断效能，与文献报道血清miR-21在诊断糖尿病肾病具有较高效能[16]类似。

本组研究发现GDM组血清miR-150表达水平明显低于糖耐量异常组和正常妊娠组，糖耐量异常组明显低于正常妊娠组，并且随着糖化血红蛋白升高而降低，说明miR-150基因参与了GDM疾病的发生发展过程。现已知miR-150位于19q13区域内，主要在淋巴结和脾脏的成熟淋巴细胞中表达，在抗感染和自身免疫性疾病中发挥重要作用[17,18]。在有的糖尿病研究中发现1型糖尿病中出现miR-150表达明显下调，在敲除miR-150基因的糖尿病模型中发现加速糖尿病的发生[19,20]，说明miR-150基因是糖尿病发生发展的保护因子，miR-150表达降低是引起糖尿病发展的重要原因。本组研究显示临床GDM肾病组血清miR-150表达明显高于早期GDM肾病组和单纯GDM组，早期GDM肾病组明显高于单纯GDM组，并且随着肾病严重程度的升高，血清miR-150表达出现明显降低，说明miR-150在妊娠糖尿病肾脏损害中具有保护作用。本组研究发现当血清miR-150表达≤3.71时，其灵敏度为75.9%，特异性97.1%，AUC为0.896明显优于β2-MG。进一步研究发现联合miR-21，miR-150和NLR指标对GDM肾病的诊断效能明显提高，其灵敏度高度96.6%，特异性97.1%，AUC为0.995明显高于单个指标miR-21，miR-150和NLR的诊断效能，说明三个指标之间具有一定的互补性，能够提高各个指标的诊断效能。

总之，miR-150和miR-21参与了GDM发生发展，联合检测miR-150，miR-21和NLR在早期诊断GDM肾损伤具有较高的诊断效能。