分子生物技术在蓝藻基因及毒素分析中的运用

（江苏省淮安环境监测中心，江苏 淮安 223001）

0 引言

随着人类社会经济不断发展，越来越多的废水排入水体，水中N，P 含量急剧增加，为藻类提供了丰富的营养物质，造成藻类大量增殖，水体富营养化和蓝藻水华现象在世界各地频繁爆发[1]。饮用水水源地受到污染威胁，水体中的蓝藻及蓝藻毒素直接危及饮用水安全，藻华及毒素的监控技术成为当今科学研究的热点之一。传统的蓝藻水华监测方法主要通过显微镜镜检法对水体中的藻细胞计数并分类，后来又通过藻类的16S rDNA 序列分析进行藻种分类，然而这些方法不能区分产毒微囊藻和非产毒微囊藻，因此不能在蓝藻暴发之前进行准确预测[2-3]。现采用实时定量聚合酶链式反应（qPCR）的方法对淮安地区5 个饮用水源地的水体蓝藻基因及毒素进行分析和评价，探索qPCR 用于水源地预警监测的可行性。

1 蓝藻毒素的种类及危害

蓝藻毒素是水华蓝藻细胞破裂后释放出来的有毒次级代谢产物，在淡水中的种类很多。根据毒素对生物的毒性作用及毒素的化学组成和结构，蓝藻毒素主要分为作用于肝脏的肝毒素和作用于神经系统的神经毒素2 种类型，其它还有细胞毒性、皮肤毒性和刺激毒性藻毒素，如脂多糖、皮肤毒素等，主要包括微囊藻毒素(microcystin)、节球藻毒素(nodularin)和柱孢藻毒素(cylindrospermopsin)等[4-5]。但是并非所有的蓝藻都会产生藻毒素，因为藻类是否能够产生藻毒素，取决于细胞中是否含有产毒基因。产毒藻基因组中含有相关藻毒素合成酶基因，可对毒素合成进行调控；非产毒藻中不含产毒基因，两者在遗传特征上存在明显差异。蓝藻产生的毒素见表1[6]。

表1 蓝藻毒素及主要产毒藻类

2 研究方法

2.1 方法原理

分子生物学技术中的实时定量聚合酶链式反应（qPCR）是利用高度专一性引物及探针结合到目的基因片段上，通过复制扩增该目的基因片段，使该技术的检出限非常低（达到25 copies/mL），通过不同波段的检测器检测荧光，根据基因的荧光信号达到阈值时的扩增的循环次数来定量目的基因。qPCR 中目的基因片段经过引物及探针2 次高辨识度的筛选，基本上不会错误识别基因片段，数据的错误率极低。实验通过qPCR 技术检测水体中2 项蓝藻基因（总微囊藻基因、总柱孢藻基因）、3 项产毒基因（产毒微囊藻基因、产柱孢藻毒基因、产蛤蚌毒素基因）与2 项产臭基因（产2-MIB 基因、产土味素基因）的浓度含量，再结合酶联免疫吸附（ELISA）技术分析3种蓝藻毒素（微囊藻毒、柱孢藻毒及蛤蚌毒素），用气相色谱-质谱联用技术测定2 种臭味素（2-MIB 和土味素）的含量，并对其结果一致性进行比较。

2.2 点位设置

在淮安市区的4 个饮用水源地和1 个白马湖备用水源地各设置1 个点位，分别为城南取水口、市取水口、淮阴区取水口、开发区取水口和白马湖备用水源地取水口。

2.3 样品采集与采样时间

2019年12月中旬按地表水采样规范要求[7]在5个点位各采集1 L 水样，在备用水源地加采1 个平行样，低温冷藏运回实验室进行分析。

2.4 仪器和方法

分析方法：蓝藻基因和产毒产臭基因采用qPCRTaqMan 法，分析仪器为CFX Connect 荧光定量PCR 检测系统(BioRad)；藻毒素采用酶联免疫吸附ELISA 法，分析仪器为酶联仪Multiskan FC Microplate Photometer；2 种臭味素采用气相色谱-质谱联用技术SPME-GCMS 法，分析仪器为气相层析仪GC/MS6890A(Agilent)。

3 结果与分析

3.1 蓝藻基因及毒素结果分析

5 个水源地的蓝藻基因及毒素的分析结果详见表2。由表2中可知：

（1）饮用水源地已受蓝藻水华影响，其中普遍存在产柱孢藻毒基因(基因浓度为6.5×103～2.5×104copies/mL)及毒素(毒素值在0.07～0.17 μg/L)，表明已经存在具有产柱孢藻毒能力的蓝藻且已产生柱孢藻毒。虽然柱孢藻毒并未超过世界卫生组织(WHO)的建议值（1 μg/L），但采样点已暴露于柱孢藻毒的风险中，需持续关注产柱孢藻毒基因的消长。

（2）除了开发区取水口外，其它测点均检出总微囊藻基因，且市取水口、城南取水口及白马湖平行样皆检出产毒微囊藻基因。由于样品中并未检出微囊藻毒，推测蓝藻产毒基因并未表现进而产生微囊藻毒。需持续关注微囊藻的生长状态，避免微囊藻毒的暴露风险。

（3）所有采样点产蛤蚌毒素基因及蛤蚌毒素均为未检出，说明暂无蛤蚌毒素的危害风险。

表2 蓝藻基因及毒素分析结果

3.2 蓝藻基因及臭味检测结果分析

5 个水源地的蓝藻基因及嗅位物质的检测分析结果见表3。分析表3可知，除了备用水源外所有采样点均无土味素和2-MIB 的风险存在。白马湖备用水源检出微量产2-MIB 基因，且同时检出微量2-MIB，表明备用水源已存在具有产2-MIB 能力的蓝藻。该结果与化学分析方法检测结果基本相同，体现了分子生物学方法和化学分析方法检测结果的高度一致性。

表3 蓝藻基因及臭味分析结果

4 结论

（1）本次共调查4 个饮用水源地和1 个备用水源地，有3 个采样点检出柱孢藻毒，说明饮用水源存在柱孢藻毒的污染风险，须密切注意具产柱孢藻毒能力的蓝藻生长状况；4 个采样点检出总微囊藻基因但整体基因浓度较低，且未检出微囊藻毒，表明目前水源地暂无微囊藻毒的风险，但仍需持续关注微囊藻的基因浓度是否增加而诱发微囊藻毒的生成；所有采样点的产蛤蚌毒素基因及蛤蚌毒素均未检出，表明不存在蛤蚌毒素的危害风险。

（2）所有饮用水源地均未检出产2-MIB 基因和产土味素基因，说明不存在蓝藻臭味物质的污染风险；白马湖备用水源检出微量产2-MIB 基因和2-MIB，说明该采样点已存在产2-MIB 能力的蓝藻，具有一定的蓝藻臭味物质污染风险，需持续关注。

（3）蓝藻水华及其毒素污染已成为饮用水安全的主要危害之一，由此带来的水生态健康风险也是当前研究的热点[8]。该实验验证了分子生物学方法和化学分析方法对水源地蓝藻基因及藻毒素监测结果的高度一致，认为该技术可作为鉴定产毒蓝藻和非产毒蓝藻更加有效的手段，能在藻毒素暴发前做出预警，在饮用水源预警监测和保护中具有广阔的应用前景[9]。