静电场调控p53合成对成纤维细胞增殖周期的影响*

梁媛媛 涂 晔 安晓强 江 键△ 崔黎丽#

（1 海军军医大学卫勤系数理教研室，上海 200433；2 上海市东方医院，上海 200120；3 海军军医大学药学院无机化学教研室，上海 200433）

细胞的迁移、生长和增殖是重要的生命运动，它在哺乳动物的胚胎发育、创面修复、炎症反应等各种生理和病理过程中起着至关重要的作用[1-5]。

细胞是一类电偶极子，在外电场作用下细胞膜表面会产生极化现象，驻极体产生的稳定外静电场对调控细胞的生长、分化、增殖和趋电迁移具有重要影响[6-11]。研究驻极体对细胞迁移和增殖的影响具有重要的基础研究意义和临床应用价值。前期的大量研究结果虽然已经基本明确驻极体产生的外电场可以调控细胞的生长、增殖、迁移和凋亡等，但对驻极体调控细胞增殖和凋亡的作用机制及其调控路径的研究较少，尤其是与细胞增殖密切相关的细胞周期及其周期调控机制的研究更是鲜见报道。p53基因介导的细胞信号转导途径在调节正常细胞的生命活动中其重要作用[12-14]。本文研究驻极体静电场调控p53 合成对成纤维细胞生长和增殖的影响，为驻极体生物效应研究提供新途径和新思路。

1 材料和方法

1.1 驻极体的制备和分组

膜厚为13 μm的聚丙烯（polypropylene，PP）商品膜（东丽株式会社，日本），经低温等离子体放电系统（电晕充电系统）制备成不同表面电位的正极性和负极性驻极体（双裸面，无金属电极）。针尖电压为：-15 kV；栅压分别为5 000V 和-5 000V；充电时间为5 min。驻极体的等效表面电位通过振动电容静电计（北京华晶科技有限公司）测量。将表面电位为0的PP膜设为对照组，将表面电位为5 000V 和-5 000V的驻极体分别设为5 000V 驻极体组和-5 000V 驻极体组，简称5 000V组和-5 000V组。

1.2 动物和主要试剂

清洁级SD雄性大鼠，体质量（180±20）g，购自海军军医大学实验动物中心。胰蛋白酶、胎牛血清、1640培养基和双抗等购于Gibco公司；PBS缓冲液购于Servicebio公司；CCK-8 试剂盒购于东仁化学科技（上海）有限公司；RNA 提取液购于武汉赛维尔生物科技有限公司；Hoechst 33342 购于上海如吉生物科技有限发展公司；定量PCR引物由武汉擎科创新生物科技有限公司提供；水合氯醛等常用试剂均购于中国医药集团化学试剂有限公司。

1.3 成纤维细胞培养

将大鼠麻醉后剔除背部毛发，洁净背部皮肤，取下皮肤组织，用含有青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）的PBS 缓冲液冲洗，洗净后将皮肤组织剪成小块（1～2 mm3）置于含有20%胎牛血清的1640培养基的培养皿中，待成纤维细胞从组织块周围爬出，待爬出的细胞有较多数量时，吸取培养液并用0.25%胰蛋白酶37℃消化细胞1～2 min，转入另一培养瓶中培养进行细胞传代，待细胞传至3～8 代后进行后续实验。

1.4 成纤维细胞增殖活性检测

取对数生长期第3代的成纤维细胞接种于96孔培养板中（细胞密度104个/孔），将表面电位为0、-1 000、-2 000、-5 000、1 000、2 000V和5 000V驻极体分别作用于成纤维细胞24、48 h和72 h。随后向各孔的细胞液中加入CCK-8试剂10 μL，继续培养1～4 h后，振荡摇匀后用全自动酶标仪（北京诺亚威仪器仪表有限公司）在450 nm波长处测定各实验组细胞的吸光度值（OD值），吸光度值越高，表示细胞的增殖活性越强。相对增殖能力强弱用细胞增殖率表示：增殖率=（实验组OD值-空白组OD平均值）/（对照组OD平均值-空白组OD平均值）。式中空白组为无细胞的培养组。

1.5 细胞周期检测

取对数生长期第3 代的成纤维细胞，在培养皿（已去除培养液）中加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶消化2 min后，制成2×107/L的单细胞悬液，接种于6孔培养板内，在1640培养液中培养24 h，将0、-5 000V 和5 000V 驻极体作用成纤维细胞48 h后，收集细胞，采用流式细胞仪检测各实验组的细胞周期。

1.6 成纤维细胞p53 mRNA表达检测

取对数生长的成纤维细胞，将0V、-5 000V和5 000V驻极体作用成纤维细胞48 h后，加入TRIzol 裂解液提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，定量检测扩增p53的mRNA转录水平。p53上游引物序列为5'-GAAGCCCTCCAAGTGTCAGC-3'，下游引物序列为5'-GGCAGAACAGCTTATTGAGGGA-3'。PCR反扩增条件为95℃ 5 s、58℃ 20 s、72℃ 31 s，39个循环。采用公式2-ΔΔCT计算mRNA表达量，每个样品取3个复管，取均值。

1.7 统计学处理

采用SPSS Statistics 19.0 软件进行数据分析，符合正态分布的计量数据用±s表示，两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 驻极体电荷储存稳定性

结果（图1）显示经常温等离子体制备的不同表面电位正、负极性聚丙烯驻极体的等温表面电位衰减曲线，常温充电的正极性和负极性聚丙烯驻极体具有优异的电荷储存稳定性。在常温下存放24 h，-1 000、-2 000V 和-5 000V 驻极体的等效表面电位分别是初始电位的80%、76%和65%；在常温下存放72h，-1 000、-2 000V 和-5 000V 驻极体的等效表面电位分别是初始电位的77%、73%和63%。说明不同表面电位的负极性驻极体可以提供稳定的外静电场用于后续细胞学实验（图1A）。且相同表面电位正、负极性驻极体的电荷储存具有相似的规律（图1B）：常温下存放72 h，5 000V 驻极体的等效表面电位为初始值的62%，与-5 000V 驻极体在常温下存放72 h的等效表面电位（初始值的63%）基本一致，这表明相同表面电位的正、负极性驻极体能够提供大小相同的外静电场。

图1 不同表面电位驻极体等效表面电位随时间的变化规律

2.2 驻极体对成纤维细胞增殖能力的影响

与对照组相比，不同表面电位负极性驻极体作用成纤维细胞72 h，细胞的增殖能力逐渐增强，驻极体的等效表面电位越高（提供的静电场强度越大），成纤维细胞的增殖能力越强（图2）。-5 000V 驻极体组细胞的增殖能力较对照组提高（1.080±0.051）倍。不同表面电位正极性驻极体作用成纤维细胞72 h，细胞的增殖能力逐渐减弱，驻极体的等效表面电位越高（提供的静电场强度越大），成纤维细胞的增殖能力越弱。5 000V 驻极体组细胞的增殖能力是对照组的（0.900±0.059）倍（图3）。负极性驻极体促进成纤维细胞的增殖作用和正极性驻极体抑制成纤维细胞的增殖作用与驻极体（或静电场）的作用时间呈正相关。

图2 不同表面电位正极性和负极性驻极体作用成纤维细胞72 h 对细胞增殖能力的影响

图3 正极性和负极性驻极体作用成纤维细胞不同时间对细胞增殖能力的影响

2.3 驻极体对成纤维细胞生长周期的影响

与对照组相比，经-5 000V驻极体作用48 h的细胞群中处于G1期的细胞数明显下降，从77.79%±0.52%下降至72.63%±0.07%；而G2期的细胞数显著上升，从13.07%±0.99%增加至23.85%±0.76%（图4B），这说明负极性驻极体作用成纤维细胞，缩短了细胞在G1期所滞留的时间，使细胞快速通过S期到达G2期，负极性驻极体具有促进细胞生长的机制之一是缩短细胞的生长周期。5 000V驻极体作用成纤维细胞48 h，处于G1期细胞的比例较对照组显著上升从77.79%±0.52%上升至81.43%±0.17%，而G2期的细胞明显下降从13.07%±0.99%减少至11.85%±0.52%（图4C），这说明正极性驻极体产生的外静电场通过使细胞阻滞于G1期而抑制细胞的生长。

图4 不同实验组作用成纤维细胞48 h后的细胞周期图

2.4 驻极体对成纤维细胞p53 mRNA表达的影响

5 000 V 驻极体和-5 000V 驻极体分别作用成纤维细胞48 h后，与对照组相比，经5 000V 驻极体作用48 h后成纤维细胞中p53 mRNA的表达量为1.30±0.10，是对照组的1.3倍（P＜0.05）。而经-5 000V 驻极体作用48 h后成纤维细胞中p53 mRNA的表达量却下降至0.71±0.07，是对照组的0.7倍（P＜0.05）。提示负极性驻极体通过下调细胞内p53基因的表达水平，诱导细胞快速通过G1期，实现促进细胞增殖的作用。

3 讨论

低频电场的生物效应是一个复杂的问题。已有很多报道表明电刺激可以影响生物大分子的合成与分解，离子通道的变化，以及细胞增殖等[15-18]。转化生长因子β（TFG-β）和p53基因是细胞周期的重要调控因子。p53基因可通过抑制有丝分裂的过程，阻止细胞进入DNA 合成期，其表达增加能够促使细胞凋亡[19]。我们在前期系统研究驻极体对成纤维细胞TFG-β 调控规律的基础上[20]，研究驻极体静电场对成纤维细胞p53基因的影响。通过研究成纤维细胞在不同极性和表面电位的驻极体静电场过作用下，细胞增殖、凋亡及凋亡基因表达的变化，阐述驻极体静电场调控p53 合成对成纤维细胞生长和增殖的影响。

本实验的研究结果显示：经低温等离子体放电系统制备的不同极性聚丙烯驻极体具有优异的电荷储存能力，且负极性驻极体具有促进细胞生长和增殖的作用，而正极性驻极体具有抑制细胞生长和增殖的作用。此外，负（或正）极性驻极体促进（或抑制）细胞生长和增殖的作用与驻极体产生的外静电场强度以及电场作用细胞的时间长短呈正相关。正极性驻极体通过上调细胞内p53基因的表达，导致细胞阻滞于G1期，从而抑制细胞的增殖。而负极性驻极体则通过加快细胞通过G1期限制点的时限，促进了细胞的增殖。因此进一步证明，驻极体产生的静电场通过调节细胞内p53 mRNA的表达量来实现对细胞增殖能力的调控。我们推测这是因为：驻极体产生的静电场作用于成纤维细胞的主要作用靶点是细胞的细胞膜，静电场作用于成纤维细胞，导致细胞的膜电位（或膜电容）发生改变，从而导致成纤维细胞的极化，以及细胞膜上各类膜蛋白、糖蛋白、氨基酸、生长因子和细胞因子等极化和再分布，由此影响成纤维细胞的生长周期，调控细胞的分化与增殖。

综上所述，当细胞处于外静电场环境下，电场作为外源刺激因子将引起成纤维细胞的细胞周期发生变化，可能是通过调控细胞内p53 mRNA的表达水平从而调控细胞的分化与增殖。