DAPK3和CDK8在宫颈癌组织中的表达及与预后的关系研究

鲁自鑫 王 玉 王 莉

宫颈癌(cervical cancer)是妇科恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌，近年来发病趋于年轻化，根据现有的医疗手段，其生存率和治疗后复发率不容乐观，严重威胁着女性的健康[1]。多项研究表明，人乳头状病病毒(human papillomavirus，HPV)的持续感染能极大的增加宫颈癌前病变、宫颈癌的发生，绝大部分宫颈癌患者存在HPV感染[2]。但是有学者研究表明，宫颈癌的危险因素除了HPV感染之外，抑癌基因的低表达也至关重要，表现为肿瘤细胞转化过程中癌基因的激活和抑癌基因的失活了[3]。

DAPK3为1种抑癌基因，属于死亡相关蛋白激酶DAPK 家族成员，与胃癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展、转移有关，提高机体细胞的存活和增殖，增加机体对化疗的抵抗力，DAPK3的低表达会引起降低肿瘤细胞细胞调亡进程，使肿瘤细胞的生存期延长[4]。CDK8是细胞周期依赖性蛋白激酶家族成员，可以促进肿瘤细胞的分裂和增殖，使肿瘤细胞周期的顺利进行。

因此本研究通过检测宫颈癌患者宫颈癌组织标本，探讨DAPK3和CDK8在患者体内的表达情况，分析其与不同临床特征的关系，为宫颈癌的诊断和预后指示提供辅助依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2020年1月就诊于我院进行手术治疗的68例宫颈癌患者为研究对象。本研究中所用的组织标本均为临床诊断后的剩余标本，于手术过程中收集宫颈癌组织和癌旁正常组织，均为无坏死的新鲜组织，经甲醛固定、石蜡包埋切片后，进行免疫组织化学法检测。患者年龄范围为24～77岁，平均年龄为(49.45±13.74)岁，按FIGO分期标准，ⅠA～ⅠB1期 46例，ⅠB2～ⅡA期22例；高、中分化48例，低分化20例；宫颈鳞癌52例，腺癌16例；淋巴结转移11例，无淋巴结转移57例。患者及家属均充分了解研究内容并签署知情同意书，本研究已获得医院伦理委员会的准许。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①初次于我院进行治疗，且既往无其他恶性肿瘤病史； ②经病理证实，肿瘤细胞类型均为腺癌或鳞癌；③术前未接受放化疗、分子生物治疗等；④半年内无心梗、脑梗等重大疾病。

排除标准：①患者为复发性宫颈癌；②合并其他恶性肿瘤；③心、肝、肾等脏器功能不全；④术前接受放化疗、分子生物治疗等特殊治疗。

1.3 研究方法

1.3.1 主要试剂与仪器 DAPK3(Proteintech)，CDK8抗体(福建迈新)，免疫组化试剂盒(中杉金桥)，DAB Kit(中杉金桥，ZLI-9032)，苏木精(中杉金桥，ZLI-9040)；病理切片机(德国Lecia公司)，组织芯片制备仪(北京博医康实验仪器有限公司)，低温高速离心机(Thermo Scientific)，电子显微镜(日本Olympus公司)，医用微波炉(Galanz)等。

1.3.2 免疫组织化学方法(IHC)步骤 所有病例均经手术和病理检查等证实为宫颈癌。将术中采集宫颈癌组织切片进行二甲苯、梯度乙醇脱蜡、3%过氧化氢中封闭15 min消除内源性酶，经抗原修复后PBS缓冲液洗3次×5 min，滴加山羊血清封闭内源性生物素，加一抗(湿盒内4 ℃过夜存放)，PBS洗3次×5 min，加二抗(37 ℃避光孵育30 min)，PBS洗3次×5 min，加辣根酶标记卵酶链白素，PBS洗3次×5 min，DAB显色10～60 s，水洗终止显色，苏木精复染40～60 s，经盐酸酒精分化后，固定封片，镜下观察染色强度、评分。

1.3.3 染色评分标准 参照免疫组化结果评分系统(Dako，HercepTest Interpretation Manual)制定细胞核抗原半定量评价，镜下观察组织芯内阳性表达最显著的区域，细胞核着色明显为阳性。阳性细胞百分比评分：0分为阳性细胞数，1分为阳性细胞数<10%，2分为阳性细胞数11%～50%，3分为阳性细胞数51～75%，4分为阳性细胞数>75%。染色强度评分：0分为无染色，1分为轻度染色，2分为中度染色，3分为重度染色。表达强度=阳性细胞百分比评分×染色强度，0分为阴性，1～5分为低表达，6分及以上为高表达。

1.4 数据处理

以SPSS 19.0对数据进行分析，计数资料采用率(%)表示，计量资料使用 χ2检验，生存分析采用Cox回归分析，P<0.05 为具有统计学意义。

2 结果

2.1 DAPK3和CDK8在宫颈组织中的表达

宫颈癌组织中DAPK3低表达率为98.53%(67/68)，显著高于癌旁正常组织的8.82%(6/68)，CDK8在宫颈癌组织中的阳性表达率为92.65%(63/68)，显著高于癌旁正常组织的10.29%(7/68)(P>0.05)。

2.2 DAPK3、CDK8与宫颈癌临床特征的关系

不同年龄段、不同FIGO分期、不同组织学类型和分化程度宫颈癌患者DAPK3和CDK8的表达情况无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 DAPK3、CDK8与不同临床特征宫颈癌的关系(例，%)

2.3 DAPK3、CDK8表达与宫颈癌患者预后的关系

本研究中无进展生存时间平均为40个月，对DAPK3、CDK8表达情况和患者总生存及临床病理参数进行分析，结果见表2所示。单因素回归分析显示，DAPK3(P=0.031)低表达较之高表达，CDK8(P=0.040)高表达较之低表达，显著增加宫颈癌患者的死亡风险，FIGO分期为ⅠB2～ⅡA期(P=0.000)和低分化程度(P=0.028)也是患者死亡的风险因素。多因素回归分析显示，DAPK3低表达(P=0.004，HR=1.762，95%CI：1.189～2.483)、CDK8高表达(P=0.017，HR=1.688，95%CI：0.985～2.157)，与患者的不良预后密切相关，可作为独立预测指标。

表2 宫颈癌组织标本单因素和多因素回归分析

3 讨论

宫颈癌是我国常见的恶性肿瘤之一，据估计，每年约有50多万的新发病例和27万的死亡病例[5]。对于早期的宫颈癌，手术是首选治疗方式，中晚期则以放化疗为主，早期宫颈癌经治疗后患者5年生存率为86.48%[6]，表明及早的治疗能有效阻止肿瘤的进展，因此探索宫颈癌的分子诊断方法是很有必要的。

DAPK3属于死亡相关蛋白激酶DAPK家族成员，参与细胞周期、增值、凋亡以及自噬的调控，为1种肿瘤抑制因子，在恶性肿瘤的发生发展中有重要作用[7-9]。DAPK3也参与了细胞有丝分裂、肌丝调节以及平滑肌细胞收缩等，其表达的缺失会降低细胞调亡进程，延长了恶性肿瘤细胞生存期，引起癌细胞增殖率的增加，提高了肿瘤细胞对化疗的抵抗作用[10]。这与本研究中DAPK3在宫颈癌组织中的低表达状态一致。宫颈癌由肿瘤细胞和间质构成，肿瘤组织中的血管在其生长扩散过程中有重要的作用[11]，CDK8可结合细胞周期蛋白，维持细胞周期的有序进行[12]。有学者研究表明，CDK8对宫颈癌的发生发展有促进作用，这与本研究结果类似。

本研究对宫颈癌患者宫颈癌组织和癌旁正常组织中DAPK3和CDK8表达水平进行检测分析，显示宫颈癌组织中DAPK3低表达率为98.53%，显著高于癌旁正常组织的8.82%，CDK8在宫颈癌组织中的阳性表达率为92.65%，显著高于癌旁正常组织的10.29%(P>0.05)。

临床已有DAPK3在胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤中表达量下调的报道，且DAPK3的下调与肿瘤分期、分化程度等存在一定的相关性[13-14]。在宫颈癌中，DAPK3下调可能与Hela细胞的增殖分化有关。本研究对宫颈癌患者DAPK3和CDK8表达情况与不同年龄、FIGO分期、组织学类型和分化程度的关系进行分析，结果表明不同年龄段、不同FIGO分期、不同组织学类型和分化程度的DAPK3和CDK8的表达情况无统计学差异(P>0.05)。

应用分子标志物辅助临床分期和组织病理形态，为准确的预测预后和指导治疗提供新的途径。本研究中无进展生存时间平均为40个月，对DAPK3、CDK8表达情况和患者总生存及临床病理参数进行分析，单因素回归分析显示，DAPK3(P=0.031)低表达较之高表达，CDK8(P=0.040)高表达较之低表达，显著增加宫颈癌患者的死亡风险，FIGO分期为ⅠB2～ⅡA期(P=0.000)和低分化程度(P=0.028)也是患者死亡的风险因素。多因素回归分析显示，DAPK3低表达(P=0.004，HR=1.762，95%CI：1.189～2.483)、CDK8高表达(P=0.017，HR=1.688，95%CI：0.985～2.157)，与患者的不良预后密切相关，可作为独立预测指标。

综上所述，宫颈癌患者宫颈癌组织中DAPK3呈低表达状态，CDK8呈高表达状态，低水平的DAPK3和高水平的CDK8提示患者预后不良。