lncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌组织中的表达及对膀胱癌T24细胞生物学特性的影响

常俊锴 侯俊清 朱朝阳 李晓东 李铁强 徐卫波 赵小磊 徐文超

膀胱癌(bladder cancer，BC)是全世界最常见的泌尿科恶性肿瘤之一[1-2]。尽管膀胱癌患者接受了根治性膀胱切除术、放射疗法以及术后化学或免疫疗法，但他们的预后仍然很差[3]。由于高复发率和死亡率，迫切需要寻找用于诊断治疗膀胱癌的新型分子生物标志物。长非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一种内源RNA，长度超过200 nt，无开放阅读框(open reading frames，ORF)，因而lncRNAs无法编码蛋白质，只能调节基因的表达[4]。越来越多的证据表明，lncRNAs参与了多种人类癌症的发生和发展[5-7]。此外，lncRNAs可能是包括膀胱癌在内许多癌症诊断和预后的潜在治疗靶点和生物标志物[8-10]。锌指蛋白多型2反义RNA 1(Zinc finger protein multitype 2 antisense RNA 1，ZFPM2-AS1)是位于8号染色体上的一种lncRNA[11]。Yan等[12]揭示了ZFPM2-AS1与肝细胞癌的进展有关。Kong等[13]研究表明ZFPM2-AS1通过抑制p53途径促进胃癌进展。然而，ZFPM2-AS1在膀胱癌中的表达和作用尚未阐明。本研究将通过研究lncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌中的表达及其对膀胱癌细胞T24增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响，进一步揭示膀胱癌发生发展的分子机制，以期为膀胱癌诊断治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 胎牛血清、F12K、RPMI-1640、DMEM细胞培养基购自美国 Hyclone 公司；lncRNA ZFPM2-AS1引物、siRNA购自上海吉玛生物制药有限公司；Trizol、Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒、2×SYBR Green Real time PCR Master Mix购自宝生物工程(大连)有限公司；放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒、MTT试剂盒、GAPDH抗体购自碧云天生物技术公司；Transwell小室购自美国康宁公司；p-β-catenin、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1购自美国 abcam公司，二抗购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 一般资料 收集2017年5月至2019年5月河南大学淮河医院泌尿外科行手术切除治疗的膀胱癌患者癌组织和癌旁组织样本共102例，其中患者男性80例，女性22例；年龄32～76岁，平均年龄(43.7±17.1)岁；TNM分期Ⅰ～Ⅲ期42例，Ⅳ期60例。所有样品在采集后立即冷冻保存在-80 ℃处，并经至少两名病理医生诊断为膀胱癌组织。所有患者术前未接受任何治疗，都清楚地知道这些样本将在将来使用，然后签署知情同意书。本研究经伦理学委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1购自美国ATCC公司；膀胱癌细胞T24、J82和5637购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；SV-HUC-1细胞用含10%胎牛血清的F12K培养基培养，5637用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，T24和J82细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，所有细胞均置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中。

1.2.2 细胞转染 取对数生长期T24细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达50%时，将3.3 μl的Lipofectmine 2000和阴性对照siRNA、lncRNA ZFPM2-AS1 siRNA两种干扰序列与250 μl Opti-MEM混匀，室温孵育15 min后加入细胞中，分别记为沉默对照组、沉默ZFPM2-AS1组，培养6 h后更换新鲜培养基，继续培养至48 h后进行后续实验研究。

1.2.3 qPCR检测 利用TRIzol试剂盒提取膀胱癌组织样本和细胞中总RNA，逆转录试剂盒进行反转录，2×SYBR Green Real time PCR Master Mix试剂盒检测lncRNA ZFPM2-AS1表达，以GAPDH为内参。lncRNA ZFPM2-AS1正向引物：5'-CTA CTG CAG TGG GAG GCA AA-3'，反向引物:5'-AGG GGC ATT TAC CAC TGT GTG-3'；GAPDH正向引物：5'-TAT GAT GAT ATC AAG AGG GTA GT-3'，反向引物5'-TGT ATC CAA ACT CAT TGT CAT-3'。

1.2.4 细胞增殖检测 取对数生长期各组T24细胞分别接种于96孔板中，密度为4×103个/孔，细胞培养24 h、48 h和72 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液继续培养4 h，然后弃去上清液，每孔加入150 μl 二甲基亚砜，酶标仪震荡10 min以溶解结晶并检测490 nm处各孔吸光值。

1.2.5 细胞克隆形成实验 取对数生长期各组T24细胞分别接种于6孔板中，密度为1×103个/孔，培养过程中每72 h更换一次培养基，培养12 d后，用甲醇固定细胞，结晶紫染色，显微镜下观察并拍照，计数含有大于50个细胞的克隆数。

1.2.6 细胞划痕实验 取对数生长期各组T24细胞接种于6孔板中，培养过夜待细胞融合度达到90%时，用无菌200 μl枪头进行划痕，后吸弃上清，PBS洗去漂浮细胞，加入无血清培养基并在显微镜下拍照，此时记为0 h，继续培养48 h后取出拍照，此时记为48 h。划痕闭合率=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.2.7 细胞侵袭实验 取预铺基质胶的Transwell小室置于24孔板中，每孔加入50 μl无血清培养基润化30 min，后取2组5×104个对数生长期T24细胞接种至上室中，下室中加600 μl完全培养基，每组设置3个复孔。培养48 h后，弃上清，PBS洗涤2次，用甲醇固定细胞，结晶紫染色，显微镜下观察并拍照，计数各组侵袭细胞数。

1.2.8 Western blot检测 RIPA裂解液提取2组对数生长期T24细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取适量蛋白用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel-electrophoresis，SDS-PAGE)电泳分离并转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别用β-catenin、p-β-catenin、c-Myc、Cyclin D1和GAPDH一抗稀释液于4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后，二抗稀释液室温孵育2 h，后经TBST洗涤后用ECL发光液孵育条带并置于化学发光成像系统中进行曝光显影，Image J软件分析各个蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 膀胱癌组织及膀胱癌细胞中lncRNA ZFPM2-AS1的表达

qPCR检测102对膀胱癌组织样本和膀胱癌细胞系中lncRNA ZFPM2-AS1表达结果显示，膀胱癌组织中lncRNA ZFPM2-AS1表达(4.92±3.85)高于癌旁组织(1.83±1.29)，膀胱癌细胞T24、J82和5637细胞中lncRNA ZFPM2-AS1表达(5.92±0.62、3.02±0.34、4.85±0.61)高于正常膀胱上皮细胞(1.02±0.10)，差异均有统计学意义(t=7.686、13.514、9.775、10.732，P<0.01)。

2.2 沉默T24细胞中lncRNA ZFPM2-AS1的表达

qPCR检测结果显示，沉默ZFPM2-AS1组T24细胞中lncRNA ZFPM2-AS1表达水平(0.14±0.02)低于沉默对照组(0.98±0.09)，差异有统计学意义(t=15.781，P=0.003)。

2.3 沉默lncRNA ZFPM2-AS1对膀胱癌细胞T24增殖的影响

MTT检测结果显示，48、72 h时沉默ZFPM2-AS1组T24细胞相对吸光度值较沉默对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，表明沉默lncRNA ZFPM2-AS1可显著抑制膀胱癌细胞T24增殖。见表1。

表1 沉默lncRNA ZFPM2-AS1后T24细胞相对吸光度值变化

2.4 沉默lncRNA ZFPM2-AS1对膀胱癌细胞T24克隆形成的影响

沉默ZFPM2-AS1组T24细胞克隆数(97.54±19.64)较沉默对照组(257.57±46.25)明显减少，差异有统计学意义(t=5.516，P=0.015)。见图1。

图1 沉默lncRNA ZFPM2-AS1抑制T24细胞克隆形成

2.5 沉默lncRNA ZFPM2-AS1对膀胱癌细胞T24迁移的影响

沉默ZFPM2-AS1组T24细胞划痕闭合率[(33.19±3.89)%]较沉默对照组[(61.35±6.87)%]明显减少，差异有统计学意义(t=6.178，P=0.007)。见图2。

图2 沉默lncRNA ZFPM2-AS1抑制T24细胞迁移(×100)

2.6 沉默lncRNA ZFPM2-AS1对膀胱癌细胞T24迁移的影响

沉默ZFPM2-AS1组T24细胞侵袭细胞数(41.43±9.85)较沉默对照组(152.39±15.71)明显降低，差异有统计学意义(t=10.365，P=0.001)。见图3。

图3 沉默lncRNA ZFPM2-AS1抑制T24细胞侵袭(×100)

2.7 沉默lncRNA ZFPM2-AS1对膀胱癌细胞T24中Wnt/β-catenin信号通路的影响

沉默对照组T24细胞中p-β-catenin、β-catenin及其下游蛋白c-Myc和Cyclin D1蛋白相对表达量分别为0.48±0.05、1.14±0.11、0.68±0.07和0.56±0.06；沉默ZFPM2-AS1组T24细胞中p-β-catenin、β-catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白相对表达量分别为1.18±0.13、0.44±0.05、0.24±0.02和0.36±0.04。与沉默对照组比较，沉默ZFPM2-AS1组T24细胞中β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表达明显降低，p-β-catenin蛋白表达显著增加，差异均有统计学意义(t=10.034、10.468、4.804、8.705，P<0.01)。见图 4。

图4 Western blot检测沉默lncRNA ZFPM2-AS1后T24细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达

3 讨论

膀胱癌是全世界泌尿系统常见的癌症之一[14]。据2015年中国癌症统计显示，膀胱癌的死亡率和发病率在泌尿系统恶性肿瘤中排名第一，诊断出约80500例新病例，并导致约32900例死亡[15]。与前列腺癌不同，膀胱癌仍然缺乏可靠的肿瘤生物标志物[16]。即使进行全身治疗，仍有高达45%的膀胱癌患者会复发，并且膀胱癌的5年生存率还不到50%[1,17]。因此，有必要发现新的分子生物学标志物来预测临床进展和不良预后，并阐明膀胱癌发展和进展的分子机制以开发新的治疗靶标。

长非编码RNA(lncRNA)的研究进展可能为癌症研究人员提供新的思路。lncRNA是无法翻译成蛋白质的一组RNA，lncRNA占转录组的98%以上，与细胞的一系列生物学功能密切相关[18-19]。研究发现，lncRNA的失调与各种癌症的发生和发展密切相关。例如，有研究发现TINCR可抑制肺癌细胞增殖和侵袭；MCM3AP-AS1可促进肝细胞癌进展，此外，ZFAS1可以促进膀胱癌的发生[20-22]。ZFPM2-AS1是一种尚未引起广泛关注的新型lncRNA。最近的一项研究证明，ZFPM2-AS1可通过减弱p53途径促进胃癌的进展[13]。lncRNA ZFPM2-AS1可作为ceRNA通过调控miR-18b-5p/VMA21和miR-511-3p/AFF4通路参与肺腺癌进展[23-24]。此外，Liu等研究表明，ZFPM2-AS1在肾细胞癌标本和细胞中明显上调，且与肾癌患者的肿瘤分期、淋巴结转移及预后密切相关；过表达ZFPM2-AS1可显著促进肾癌细胞生长、迁移和侵袭[25]。上述结果表明，ZFPM2-AS1促进了多种肿瘤发生进展，可能是癌基因，然而，其在膀胱癌中的表达和作用仍不清楚。本研究通过qPCR检测发现，lncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌组织和细胞中高表达，沉默其表达能够显著抑制膀胱癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭，提示lncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌中是一个潜在的致癌基因。

Wnt/β-catenin信号通路是人类肿瘤中最常见的致癌信号通路之一[26]。据报道，一些lncRNAs在包括膀胱癌在内的多种癌症中可调控Wnt/β-catenin信号通路转导。例如，长链非编码RNA XIST通过调节miR-139-5p介导的Wnt/β-catenin信号通路来促进膀胱癌细胞生长和转移[27]。本研究发现，沉默lncRNA ZFPM2-AS1可显著抑制膀胱癌细胞T24中Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin及其下游蛋白c-Myc和Cyclin D1表达，上调p-β-catenin表达，表明lncRNA ZFPM2-AS1通过调节Wnt/β-catenin信号传导途径的激活在膀胱癌细胞中发挥致癌作用。

综上所述，LncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌中高表达，沉默其表达能够抑制膀胱癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关，提示lncRNA ZFPM2-AS1可能作为膀胱癌患者的新型潜在治疗靶标和预后生物标志物。