镇江地区上呼吸道病毒感染患儿鼻腔病毒谱构成

王亚楠， 张 文

（江苏大学医学院，江苏 镇江 212013）

据统计，全球≥5岁儿童严重肺炎的病死率为8.9%[1]，包括肺炎在内的严重急性呼吸道感染是儿童入院和死亡的主要原因[2]。在我国，呼吸道感染占儿科门诊的绝大部分，其中80%是呼吸道病毒感染[3]。目前，临床上常见的病毒主要有流感病毒（influenza virus，Inf）、副流感病毒（parainfluenza virus，PIV）、合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）和腺病毒（adenoviridae，ADV）等[4]。病毒的暴发性传染会给公众，尤其是免疫功能尚不健全的儿童带来巨大的威胁。如果能对环境中潜伏的呼吸道病毒进行有效的监测，及早发现具有致病性的未知病毒，或已知病毒的变异株，对疫情防控有很高的价值。

目前，临床常规的病毒检测方法有聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR）、细胞培养法、扫描电镜检测法、特异性抗体检测法[5]，但是传统方法都各有无法避免的缺点，最大的弊端是只能检测已经发现的病毒，很难检测新型病毒[6]。随着科学技术的不断进步，病毒宏基因组学逐渐成为非培养的高通量病毒核酸检测的最佳选择，其突破了传统方法的局限性，直接以环境中所有病毒的遗传物质作为研究对象，可快速鉴定出环境中所有病毒的组成，从而发现新病毒，监测病毒的变异情况。本研究采用病毒宏基因组学方法，分析上呼吸道感染患儿鼻腔微环境病毒群落的组成，从而为儿童上呼吸道病毒感染的预防及临床治疗提供帮助。

1 材料和方法

1.1 样本收集

收集2013年7月—2014年6月江苏大学附属医院100份1～6岁上呼吸道病毒感染患儿鼻黏膜分泌物拭子样本。为避免交叉感染，采集过程全部使用一次性用具。用无菌棉签采集鼻黏膜分泌物后，剪下棉签头放置于装有500 μL不含钙镁离子杜氏磷酸盐缓冲液的1.5 mL离心管内充分混匀，然后迅速放入-80 ℃冰箱冷冻保存。患儿纳入标准：近期出现咳嗽、咽痛、打喷嚏、流涕、鼻塞或发热（＞37.3 ℃）等上呼吸道感染症状的不同年龄段儿童。排除标准：（1）已服用抗菌药物或抗病毒药物；（2）细菌培养检测出致病菌；（3）无支原体和衣原体等其他非经典微生物感染。

1.2 主要仪器及试剂

0.5 mL超滤离心管（美国Millipore公司），QIAamp Viral RNA Mini Kit和PCR产物纯化试剂盒（上海Qiagen公司），SuperScript Ⅲ reverse transcriptase（Invitrogen）逆转录试剂盒、DNA消化酶及RNA消化酶（美国Life technologies公司），Nextera XT DNA Sample Preparation Kit for 96 Samples高通量测序DNA文库构建试剂盒和Nextera XT Index Kit for 96 Indexes DNA文库接头添加试剂盒（美国Illumina公司），Agencourt AMPure XP Kit（美国Beckman公司）。高通量测序平台为美国Illumina公司MiSeq台式测序仪。

1.3 方法

1.3.1 患儿鼻黏膜分泌物前处理 从-80 ℃冰箱中取出鼻黏膜分泌物悬液，冰上融化并剧烈振荡5 min，15 000×g4 ℃离心10 min，取上清过滤后收集滤液。

1.3.2 样本组合设计 随机将100份样本分成10组，并分别编号为KYD01～10，每组10份样本，每份样本各取40 μL滤液制备成混合悬液，构成10个样本池。

1.3.3 实验方法 （1）本研究鼻黏膜分泌物样本的核酸酶消化温度为37 ℃，时间为60 min。当消化反应进行30 min后，取出酶反应溶液轻轻混匀几次，依次加入反应缓冲液、DNA消化酶和RNA消化酶，使呼吸道分泌物悬液至总体积为200 μL；（2）经过酶消化后的样本中主要为病毒核酸，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit同时提取病毒DNA和RNA，混匀后置于冰上备用；（3）逆转录及合成双链DNA，提取病毒核酸后，以6种碱基随机引物进行逆转录反应合成RNA病毒的cDNA链，利用Klenow酶进行反应合成cDNA及单链DNA病毒的互补链，此时得到的反应产物是双链DNA，-20 ℃保存备用；（4）高通量测序文库的构建及文库扩增，取出保存的Klenow产物、ATM、NPM、TD buffer、NT buffer，融化、混匀后离心，按照说明书要求进行PCR扩增，反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物的分布；（5）文库纯化，用Qiaquick PCR purification Kit除去文库中的引物二聚体，保存备用，Miseq测序平台要求文库DNA长度为300～800 bp，因此本研究需使用Ampure Beads对文库DNA长度进行筛选优化，具体操作按照AMPure XP beads说明书进行；（6）病毒文库质量检测及样本内病毒群落分析，在测序前需要使用Agilent Bioanalyzer 2100生物分析仪（德国Agilent公司）对优化好的文库质量进行检测，达到测序标准才能进行深度测序，采用Illumina MiSeq测序平台进行测序，高通量测序结束后，将各样本的原始数据在江苏大学医学院病毒宏基因组学分析平台服务器内进行病毒群落分析[7]。

2 结果

测序结果显示，10个文库中的9个文库（KYD04未检出病毒）中至少有14个病毒科，种类丰富，病毒组成基本相似，但是序列数差异较大（图1）。上呼吸道感染患儿鼻腔微环境内病毒群落主要由腺病毒科（30.13%）、小RNA病毒科（24.04%）、冠状病毒科（11.22%）、指环病毒科（10.58%）、多瘤病毒科（10.58%）、副黏液病毒科（7.37%）等组成，其中腺病毒科和小RNA病毒科处于主导地位。见图2。

图1 9个文库的病毒群落组成

图2 10个文库中病毒群落的组成

3 讨论

本研究采用病毒宏基因组学技术对江苏大学附属医院100份上呼吸道病毒感染患儿鼻腔黏膜样本进行初步分析，对其中的病毒类型有了初步了解。本研究结果表明，镇江地区上呼吸道病毒感染患儿鼻腔内病毒类型较为丰富，主要为腺病毒科和小RNA病毒科。

腺病毒基因组序列具有高度的重组和变异特点。腺病毒在发生变异和重组后，易在人群中引起暴发和流行。另外，腺病毒最常发生于 6个月～2岁儿童，是引起儿童呼吸道感染的常见病毒之一，也是儿童社区获得性肺炎常见的病原体之一，患儿有较为严重的临床表现，肺外并发症多，易遗留慢性气道和肺疾病，病死率高，后遗症多，是目前造成婴幼儿肺炎致残和死亡的重要病因之一[8]。对腺病毒进行有效监测，有利于及时发现腺病毒变异及流行型别变化，从而为控制腺病毒暴发和流行提供科学证据和研究基础。

小RNA病毒科属于微小核糖核酸目，由RNA病毒中最小的类群组成，主要为人鼻病毒（human rhinovirus，HRV）和人肠道病毒（human enterovirus，HEV）。HRV是引起人类病毒性呼吸道感染的最常见病原体之一，也是人类普通感冒的主要致病因素。HRV感染全年均可发生，春秋季较流行，感染后症状轻微，易被忽略，但越来越多的证据表明HRV是引起急性呼吸道感染患儿死亡的主要病原之一，且与肺炎、细支气管炎、哮喘急性发作密切相关[9]，会引发严重的后遗症，极大地影响患者的生活质量。HEV主要经消化道、呼吸道传播，儿童为易感人群，高发于夏秋季，有一定的季节性，除引起呼吸道感染外，还可引起无菌性脑膜炎综合征、心肌炎和心包炎、肌炎和关节炎、出疹性疾病、手足口病、流行性出血性结膜炎等多种疾病[10]。

本研究发现，除一些致病性病毒外，镇江地区上呼吸病毒感染患儿鼻腔内还有一些植物病毒，如可能来源于食物或环境中的花椰菜病毒科；另外，冠状病毒科除其变异种外，较多报道于动物身上，可能与宠物接触或者饮食有关。并不能确定是否有潜在感染性，还需要进一步研究。

本研究的文库3中还发现了多瘤病毒科（10.58%），但具体是哪种病毒，是否会诱发肿瘤，还需要进一步追踪，以获得更多的数据。

病毒宏基因组学目前已被广泛应用于医学、公共卫生、环境和动物疾病等研究领域[11]。该方法主要利用病毒体积小和病毒的蛋白质衣壳对核酸有保护作用来实现对病毒的检测[12]，与传统方法比较，病毒宏基因组学在对已知和未知病毒的检测上均有强大的优势，但也有一些技术瓶颈和缺点，且因成本较高，还不能在临床普及。相信随着生物技术的发展，病毒宏基因组学一定可以展现出更多的优势，更好地造福人类。