金钱白花蛇蛋白质含量测定及抗肿瘤作用初步研究

王 维 郭 欣

金钱白花蛇来源于眼镜蛇科动物银环蛇（Bungarus multicinctus Blyth）的幼蛇干燥体，具有祛风、通络、止痉的功效，临床用于治疗风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼㖞斜，半身不遂，抽搐痉挛，破伤风，麻风等病症[1]。其含有蛋白质、脂肪、氨基酸、糖类，以及钙、磷、铁、锌等20 多种元素[2]。药理研究显示，金钱白花蛇具有良好的抗炎、镇痛、抗肿瘤作用[3]。目前，蛋白质常用化学测定手段主要有微量凯氏定氮法[4]，双缩脲试剂反应[5]，Folin-酚法（Lowry）[6]等。Folin-酚试剂是蛋白质含量测定最灵敏的方法之一，其原理是在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜离子结合生成复合物，Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物），蓝色深度与蛋白的量成正相关[7]。此法操作简单迅速不需特殊的仪器设备，且灵敏度高，15min 就有最大的显色并可稳定数小时。因此，本研究采用Folin-酚试剂法测定金钱白花蛇粉末中蛋白质含量，以期为金钱白花蛇粉末中蛋白质提取、分离、药理活性等方面的深入研究奠定基础。

1 实验材料

1.1 仪器 UV-2600 紫外分光光度计（岛津公司）、HWS26-电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）、电子分析天平（瑞士梅特勒）。

1.2 试剂 牛血清白蛋白（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号20190327）、氢氧化钠（天津市光复科技发展有限公司，批号970522）、钨酸钠（京华化工厂，批号970512）、钼酸钠（北京化学试剂公司，批号950912）、无水碳酸钠（北京化工厂，批号20150728）、蒸馏水（MILL-Q 纯水仪制备），其他试剂均为分析纯，购于北京化工厂。二甲基亚砜（DMSO，购自Solarbio）。

1.3 试验样品 不同批次的蕲蛇样品购买自浙江省金华市磐安药材城。分别编号标记为样品1（批号20190705），样品 2（SZ -20180213），样品 3（20190804），样品4（20180925）。经鉴定为眼镜蛇科动物银环蛇（Bungarus multicinctus Blyth）的幼蛇干燥体。不同批次样品分别粉碎成细粉，过筛，混合均匀，备用。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 配制Folin-酚试剂A 所需溶液制备 0.8%氢氧化钠溶液制备：精密称取氢氧化钠0.8g 于100mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，得0.8%氢氧化钠溶液。4%无水碳酸钠溶液的制备：精密称取无水碳酸钠4.0g 于100mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，得4%氢氧化钠溶液。2%酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）溶液的制备：精密称取酒石酸钾钠2.0g 于100mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，得2%酒石酸钾钠溶液。1%硫酸铜（CuSO4）溶液的制备：精密称取无水硫酸铜1g 于100mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，得1%硫酸铜溶液。

2.1.2 Folin-酚试剂A（1）4%无水碳酸钠溶液25mL，0.8%氢氧化钠溶液25mL，等体积混合。（2）2%酒石酸钾钠溶液0.5mL，1%硫酸铜溶液0.5mL，等体积混合。临用时，将（1）与（2）按体积比50:1 比例混合均匀，即得。

2.1.3 Folin-酚试剂B 将钨酸钠（H4Na2O6W）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸100mL，置1500mL 磨口圆底烧瓶中，充分溶解，混匀，装上磨口冷凝管，回流10h。然后，分别加入硫酸锂150g，水50mL 及溴液数滴，开口煮15min，去除过量的溴，冷却后稀释至1000mL，滤过（呈微绿色）贮于棕色瓶中，临用前用氢氧化钠滴定液（1mol/L）滴定，酚酞作指示剂（由于试剂量微绿色，影响滴定终点观察，可将试液稀释100 倍再滴定），根据滴定结果，用水将试剂稀释到相当于1mol/L 的酸度（稀释1 倍左右）。

2.1.4 对照品溶液制备 取牛血清白蛋白对照品约21.4mg，精密称定，置25mL 容量瓶中，加0.1mol/L 的氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.856mg/mL 牛血清白蛋白储备液。精密吸取3mL，置于25mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.103mg/mL 对照品溶液。

2.1.5 供试品溶液的制备 称取金钱白花蛇粉末约0.5g，置于100mL 量瓶中，加水适量使溶解，再加水定容至刻度，摇匀，精密吸取5mL，置于50mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，即得。

2.2 Folin-酚试剂法 精密吸取系列牛血清白蛋白标准溶液，供试品溶液（0.9mL）加水至1.6mL，选取纯净水（3.2mL）作为随行空白。分别置于具塞试管中，精密加入Folin-酚试剂A 4.0mL（空白加入8.0mL），摇匀，室温放置10min，再分别精密加入Folin-酚试剂B 0.4mL（空白加入0.8mL），摇匀，密塞，在30℃水浴中保温30min，恢复至室温，采用紫外分光光度计在660nm 波长下测定吸光度。

2.3 MTT 法测定肝癌细胞抑制率 肝癌SMMC7721细胞经体外培养后，以1.5×104/孔接种于96 孔板上，培养24h 到细胞贴壁后，将金钱白花蛇蛋白类提取物质稀释至终浓度为15mg/L（低剂量组）、30mg/L（中剂量组）、45mg/L（高剂量组）培养24h，对照组给予生理盐水30mg/L，在每个孔中加入MTT 各20μL 继续培养4h，停止培养后将培养基除去，每孔加入DMSO150μL，混合均匀，放置室温下10min。以酶标仪于490nm 测定光密度值（OD 值），细胞抑制率=（1-实验组OD 值/对照组OD 值）×100%。

3 方法学验证

3.1 线性关系 分别准确吸取2.1.4 项下牛血清白蛋白标准储备液0.0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和1.6mL，置于具塞试管中，各管加水至1.6mL，再分别精密加Folin-酚试剂A 4.0mL，摇匀，室温放置10min，再分别精密加入Folin-酚试剂B 0.4mL，摇匀，密塞，在30℃水浴中保温30min，放冷，在660nm 波长处测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，结果见图1。

图1 牛血清白蛋白标准曲线

3.2 精密度实验 精密吸取对照品溶液2mL，重复测定吸光度6 次，RSD 为0.012%，表明仪器精密度良好。见表1。

3.3 稳定性实验 精密吸取供试品溶液（样品2）2mL，分别放置0、1、1.5、2、2.5、3h 测定吸光度，供试品溶液在0～3h 内稳定性良好，RSD 值为1.550%。见表2。

3.4 重复性实验 分别称取金钱白花蛇粉末6 份，每份各取约0.5g，置于100mL 量瓶中，加水适量使溶解，再加水定容至刻度，摇匀，精密吸取5mL，置于50mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，6 份样品RSD 为0.709%，表明实验重复性良好。见表3。

表1 精密度实验结果

表2 样品稳定性实验结果

表3 重复性实验结果

表4 加样回收实验结果

3.5 加样回收试验 分别称取金钱白花蛇粉末6份，每份各约0.5g，分别向其中加入77.20mg 牛血清白蛋白对照品，置于100mL 量瓶中，加水适量使溶解，再加水定容至刻度，摇匀，精密吸取5mL，置于50mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密吸取供试品溶液0.7mL，加水至1.6mL，分别置于具塞试管中，精密加入Folin-酚试剂A 4.0mL，摇匀，室温放置10min，再分别精密加入Folin-酚试剂B 0.4mL，摇匀，密塞，在30℃水浴中保温30min，恢复至室温，采用紫外分光光度计在660nm 波长下测定吸光度，计算蛋白质含量，结果显示，蛋白质平均回收率为99.477%，RSD=0.873%。见表4。

3.6 样品含量测定 分别准确称量样品各约0.5g，按照上述样品测定方法进行制备并测定蛋白质含量。各样品蛋白质含量由高到低依次为样品2（173.380mg/g）、样品4（170.810mg/g）、样品1（153.390mg/g）、样品3（126.470mg/g）。见表5。

3.7 对肝癌SMMU7721 细胞增殖的影响 与对照组相比较，白花蛇蛋白各个剂量组肝癌SMMU7721细胞增殖抑制率均大于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。其抑制率随着浓度升高而逐渐增加，高剂量组抑制率达到67.821%。表明金钱白花蛇蛋白类物质对肝癌细胞有显著抑制作用。见表6。

表5 金钱白花蛇粉末中蛋白质含量测定结果（mg/g）

表6 MTT 法检测白花蛇蛋白对肝癌细胞增殖抑制率比较

4 讨论

本研究采用Folin-酚试剂法测定金钱白花蛇粉末中蛋白质含量。已有研究利用Folin-酚试剂法测定蛋白质总量，并证实该方法可靠、准确度高，且操作简便[8-10]。石森林和王黎霞[11]很早就采用Folin-酚试剂法测定蕲蛇中蛇毒的蛋白含量，该方法回收率能达到98.00%以上，RSD 为1.76%，且简便、稳定、重现性好。研究显示，蛇类所含的蛋白质成分有抑制类风湿关节炎细胞增殖和诱导凋亡作用[12]。通过调节P53 和P21 蛋白表达起到抗肿瘤作用等[13]。

本研究结果显示，已建立的蛋白质含量测定方法具有操作简便，灵敏度高，结果准确可靠等特点，适用于中药金钱白花蛇中蛋白质含量的测定。金钱白花蛇作为传统的中药，以鲜药组方入药用于原发性肝癌的治疗，但是其抗肿瘤机制尚不清楚。本研究结合所建立方法为金钱白花蛇蛋白质的质量控制、药效评价、药理活性筛查等后续深入研究奠定了基础。同时本研究初步研究了金钱白花蛇蛋白类提取物质对肝癌SMMU7721 细胞增殖抑制的作用。结果显示，随着蛋白给药剂量增加，其抑制率逐渐增强，提示金钱白花蛇蛋白类活性物质可能与其抗肿瘤存在一定的关系。