三七总皂苷经miR-24 靶向C-myc 对骨关节炎模型大鼠软骨细胞凋亡与增殖的影响

陈伟达 石 玮 杨继国 陈 腾

骨关节炎是骨科临床常见病，严重影响患者生活质量[1]。微小核糖核酸（miRs）是小的非蛋白质编码RNA，其与靶mRNA 的30 个非翻译区（UTR）结合并且被认为是新的基因表达调节剂。作为血管内皮细胞中发现的缺氧敏感性miR，微小核糖核酸-24（miR-24）与软骨细胞分化和增殖有关[2]。原癌基因（C-myc）可编码转录因子，以调节转录活性和细胞增殖、生长和凋亡[3]。C-myc 过表达可促进促炎介质的过量产生，如肿瘤坏死因子-α，白细胞介素-1β（IL-1β），一氧化氮（NO）和前列腺素。研究[4]证实，C-myc可作为诱导软骨细胞凋亡的诱导剂，而软骨细胞凋亡与骨关节炎的严重程度相关性明显。文献[5]报道，miR-24 可抑制C-myc 表达，进而调节软骨细胞增殖，生长和凋亡。三七总皂苷其主要成份为人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1，作用为活血祛瘀，通脉活络[6]。具有抑制血小板聚集和增加脑血流量的作用，常用于脑血管后遗症，视网膜中央静脉阻塞，眼前房出血等[7]。研究[8]表明，三七总皂苷能够保护骨关节炎大鼠的软骨细胞免于变性。本研究探讨三七总皂苷经miR-24 靶向C-myc 对骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡与增殖的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 清洁级雄性SD 大鼠购自吉林大学实验动物中心，8 周龄，体质量180～220g，动物生产许可证号：SCXK（吉）2018-0002，动物使用许可证号：SYXK（吉）2018-0023，动物质量合格证号：2019012706，适应性饲养1 周后用于本实验。

1.2 药物 三七总皂苷（原料药，纯度99%，杭州甫洛生物科技有限公司，批号CAS-2037-50）。

1.3 试剂 低葡萄糖Dulbecco 改良Eagle's 培养基（L-DMEM）溶液（美国Gibco 公司，批号M0063）；Ⅱ型胶原酶（美国Sigma-Aldrich 公司，批号SA66143）；链霉素和青霉素（武汉Procell 生命科技有限公司，批号AW65987、AW145624）；胎牛血清（FBS）、放射免疫沉淀测定裂解缓冲液、CCK-8 试剂（碧云天生物技术公司，批号BF24593、BF20119、BF11665）；FITC 膜联蛋白V 凋亡检测试剂盒（美国BD Pharmingen 公司，批号MB58741）；TRIzol 试剂、RevertAid 第一链cDNA 合成试剂盒（美国赛默飞世尔科技有限公司，批号14865、14654）；SYBR Premix Ex Taq 荧光定量PCR 试剂盒、二乙基焦碳酸酯处理水（日本Takara 公司，批号T0037、T2548）；C-myc 单克隆抗体、β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology 公司，批号P60253、HC1012）；辣根过氧化物酶缀合的山羊抗大鼠二抗、HRP 底物显色试剂盒（美国Proteintech 公司，批号SA00001-1、WBKLS0100）。

1.4 仪器 HF90 型CO2培养箱（力新仪器上海有限公司）；IX83 型倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；Bio-Tek Synergy 2 型酶标仪（美国Bio-Tek 公司）；FACS Calibur 型流式细胞仪（美国BD 公司）；NanoDrop 2000C 型分光光度计（美国Thermo Scientific 公司）；ChemiDoc XRS 型凝胶成像系统、CFX 96TM 型实时PCR 系统（美国伯乐公司）。

2 实验方法

2.1 骨关节炎大鼠模型制备 SD 大鼠麻醉后仰卧固定于手术台上，两侧后肢膝关节内侧备皮，曲屈大鼠膝关节，于关节两侧进针，在1、4、7 天分别将0.2mL 4%木瓜蛋白酶水溶液注射到膝关节腔内（刺破关节腔时有突破感，注射药物时无阻力）。随后进行膝关节Lequesne MG 评估级别，平均评分＞40 说明大鼠膝关节骨性关节炎模型建立成功[9]。

2.2 骨关节炎大鼠软骨细胞获取及培养 脱臼处死骨关节炎模型大鼠，无菌收集两侧膝关节的全部软骨组织，使用眼科剪刀将其均匀地切成1mm×1mm×1mm的片段。用L-DMEM 溶液洗涤所获骨关节炎大鼠软骨细胞。然后，将骨关节炎大鼠软骨细胞转移到含有1.5g/L Ⅱ型胶原酶的新培养皿中，然后将其置于培养箱中在37℃下孵育4h，接着将细胞悬浮液消化，用不锈钢过滤器（150 目）过滤，以3000rpm 的速度离心10min，去上清液。加入150U/mL 链霉素和150U/mL青霉素以及13% FBS 孵育24h，更换营养液，之后每3 天更换1 次营养液。在倒置显微镜下观察细胞生长直至细胞汇合达到85%后，收集细胞用于后续试验。

2.3 分组设计 骨关节炎软骨细胞组：取10mL 骨关节炎软骨细胞组液（细胞浓度为5×106/mL）于10%FBS 的DMEM 培养液中，置于CO2培养箱（37℃、5%CO2、20%O2）；三七总皂苷低、中、高剂量组细胞培养方法同骨关节炎软骨细胞组，分别加入三七总皂苷（最终浓度分别为：100、200、400μg/mL）[10]。各组细胞分别设6 个平行样本，培养72h。

2.4 骨关节炎软骨细胞活力检测 CCK-8 测定骨关节炎软骨细胞活力。各组骨关节炎软骨细胞培养结束后，每组加入10μL CCK-8 染色剂，按照制造商的说明书操作。用于比色分析的装置是Bio-Tek Synergy 2 型酶标仪，波长为450nm，读取吸光度（OD）值。细胞存活率=（实验组OD 值/空白组OD值）×100%。空白组为蒸馏水调零组。

2.5 骨关节炎软骨细胞菌落数水平测定 选择处于指数生长期的细胞并通过移液将其悬浮于单个细胞中，然后接种到10cm 培养皿中。用梯度因子进一步稀释细胞悬浮液，将约500 个细胞加入培养皿中，在37℃下培养2～3 周直至出现可见的菌落，用PBS 轻轻洗涤培养皿两次，将细菌用5mL 甲醇固定15min，用吉姆萨染色10～30min，然后计数。计数含有至少50 个细胞的活菌落。

2.6 骨关节炎软骨细胞凋亡水平测定 FITC 膜联蛋白V 凋亡检测试剂盒用于测定细胞凋亡率。将培养结束的骨关节炎软骨细胞（每孔5×105个细胞）接种到6 孔板中，重悬于1X 结合缓冲液，与5μL 异硫氰酸荧光素偶联的膜联蛋白V 和5μl PI 在黑暗中于25℃下温育15min。在1h 内进行流式细胞术分析。

2.7 骨关节炎软骨细胞miR-24、C-myc mRNA 水平测定 细胞培养结束后，使用TRIzol 试剂提取总RNA。根据制造商的说明，使用RevertAid 第一链cDNA 合成试剂盒进行逆转录，使用SYBR Premix Ex Taq 荧光定量PCR 试剂盒检测mRNA 水平。引物由日本Takara 公司设计合成。使用以下引物：miR-24 正向5'-TTCCCCAGCAACTACGTGAC-3'和miR-24 反 向5'-TCTAACAACTGAATGGGCGG-3'；C-myc 正向5'-CACGTCTCAGTGCATCACAGA-3'和C-myc 反 向5'-GTGCAGGGTCCGAGGTCCATG-3'；U6 正向5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3' 和U6反向5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'。将miR-24、C-myc mRNA 的水平标准化至U6。使用实时PCR 系统和含有cDNA 模板引物，SYBR Premix Ex Taq 试剂、二乙基焦碳酸酯处理水的PCR 混合物进行PCR。使用以下热循环条件：94℃持续10s 随后进行40 个循环，94℃10s，60℃持续20s 和72℃持续10s。使用2-ΔΔCt 方法计算miR-24、C-myc mRNA 表达水平。

2.8 骨关节炎软骨细胞C-myc 蛋白水平测定 使用放射免疫沉淀测定裂解缓冲液从骨关节炎软骨细胞中提取蛋白质，使用分光光度计定量总蛋白质浓度，通过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自每种提取物的等量（100μg）蛋白质，然后在300mA 下电转移到聚偏二氟乙烯膜上1h。用5%脱脂乳在室温下封闭1h 后，将印迹与C-myc 一抗（1：1000 稀释）以及β-actin 单克隆抗体（1：1000 稀释）在4℃过夜，与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗大鼠二抗（1：2000 稀释）孵育后，使用HRP 底物显色试剂盒以及凝胶成像系统显现蛋白质条带。使用ImageJ 软件版本进行蛋白质条带的灰度值分析以定量蛋白质水平。

2.9 统计学方法 应用SPSS 23.0 统计软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析比较，多重比较采用SNK-q 检验；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组骨关节炎软骨细胞OD 值、存活率比较与骨关节炎软骨细胞组比较，三七总皂苷低、中、高剂量组OD 值增加、存活率升高（P均＜0.05）；随着三七总皂苷剂量的增加，三七总皂苷各剂量组OD 值、存活率逐渐升高（P均＜0.05）。见表1。

3.2 各组骨关节炎软骨细胞菌落数比较 与骨关节炎软骨细胞组比较，三七总皂苷低、中、高剂量组细胞菌落数增加（P均＜0.05）；随着三七总皂苷剂量的增加，三七总皂苷各剂量组细胞菌落数逐渐增加（P均＜0.05）。见表2，图1。

表1 各组骨关节炎软骨细胞OD 值、存活率比较（）

表1 各组骨关节炎软骨细胞OD 值、存活率比较（）

注：骨关节炎软骨细胞组为骨关节炎软骨细胞；三七总皂苷低剂量组为骨关节炎软骨细胞+100μg/mL 三七总皂苷；三七总皂苷中剂量组为骨关节炎软骨细胞+200μg/mL 三七总皂苷；三七总皂苷高剂量组为骨关节炎软骨细胞+400μg/mL 三七总皂苷；OD 为吸光度；与骨关节炎软骨细胞组比较，aP＜0.05；与三七总皂苷低剂量组比较，bP＜0.05；与三七总皂苷中剂量组比较，cP＜0.05

表2 各组骨关节炎软骨细胞菌落数、凋亡率比较（）

表2 各组骨关节炎软骨细胞菌落数、凋亡率比较（）

注：骨关节炎软骨细胞组为骨关节炎软骨细胞；三七总皂苷低剂量组为骨关节炎软骨细胞+100μg/mL 三七总皂苷；三七总皂苷中剂量组为骨关节炎软骨细胞+200μg/mL 三七总皂苷；三七总皂苷高剂量组为骨关节炎软骨细胞+400μg/mL 三七总皂苷；与骨关节炎软骨细胞组比较，aP＜0.05；与三七总皂苷低剂量组比较，bP＜0.05；与三七总皂苷中剂量组比较，cP＜0.05

3.3 各组骨关节炎软骨细胞凋亡率比较 与骨关节炎软骨细胞组比较，三七总皂苷低、中、高剂量组凋亡率降低（P均＜0.05）；随着三七总皂苷剂量的增加，三七总皂苷各剂量组凋亡率逐渐降低（P均＜0.05）。见表2。

3.4 各组骨关节炎软骨细胞miR-24、C-myc mRNA表达水平比较 与骨关节炎软骨细胞组比较，三七总皂苷低、中、高剂量组细胞miR-24 mRNA 表达量增加（P均＜0.05），C-myc mRNA 表达量降低（P均＜0.05）；随着三七总皂苷剂量的增加，三七总皂苷各剂量组细胞miR-24 mRNA 表达量逐渐升高，C-myc mRNA 表达量逐渐降低（P均＜0.05）。见表3。

表3 各组骨关节炎软骨细胞miR-24、C-myc mRNA、C-myc 蛋白表达水平比较（）

表3 各组骨关节炎软骨细胞miR-24、C-myc mRNA、C-myc 蛋白表达水平比较（）

注：骨关节炎软骨细胞组为骨关节炎软骨细胞；三七总皂苷低剂量组为骨关节炎软骨细胞+100μg/mL 三七总皂苷；三七总皂苷中剂量组为骨关节炎软骨细胞+200μg/mL 三七总皂苷；三七总皂苷高剂量组为骨关节炎软骨细胞+400μg/mL 三七总皂苷；miR-24 为微小核糖核酸-24；C-myc 为原癌基因；C-myc 为原癌基因；与骨关节炎软骨细胞组比较，aP＜0.05；与三七总皂苷低剂量组比较，bP＜0.05；与三七总皂苷中剂量组比较，cP＜0.05

3.5 各组骨关节炎软骨细胞C-myc 蛋白表达水平比较 与骨关节炎软骨细胞组比较，三七总皂苷低、中、高剂量组细胞C-myc 蛋白表达降低（P均＜0.05）；随着三七总皂苷剂量的增加，三七总皂苷各剂量组细胞C-myc 蛋白表达量逐渐降低（P均＜0.05）。见表3。

4 讨论

三七总皂苷源于三七的干燥根及根茎，具有散瘀止血，消肿定痛的功能。研究表明，三七总皂苷具有抗炎、抗癌、抗氧化和抗细胞凋亡等[11]。三七总皂苷可抑制SNP 刺激的大鼠软骨细胞凋亡并改善大鼠骨关节炎模型中的软骨退化[12]。本研究结果显示，与骨关节炎软骨细胞组比较，三七总皂苷低、中、高剂量组OD值、存活率、细胞菌落数升高，凋亡率降低；随着三七总皂苷剂量的增加，三七总皂苷各剂量组OD 值、存活率、细胞菌落数逐渐升高，凋亡率逐渐降低。说明三七总皂苷具有抗骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡特性，并能促进骨关节炎大鼠软骨细胞增殖，而减轻细胞凋亡过程可以缓解软骨退变的进展。

图1 各组骨关节炎软骨细胞菌落数比较（吉姆萨染色×400）

通过对各组软骨细胞miR-24 mRNA 分析结果显示，与骨关节炎软骨细胞组比较，三七总皂苷低、中、高剂量组细胞miR-24 mRNA 表达水平增加。结合前述各组软骨细胞凋亡、增殖水平；推测miR-24 可以促进细胞增殖，并抑制软骨细胞凋亡。动物实验证实，miR-24 可能在促进增殖和预防软骨细胞凋亡中起重要作用[13]。miR-24 是一种潜在的基因和药物治疗靶点，能够抑制脑梗死大鼠脑组织细胞凋亡，此外，miR-24 所起的抗细胞凋亡作用也可能在细胞增殖中起作用[14]。本研究结果显示，随着三七总皂苷剂量的增加，三七总皂苷各剂量组细胞miR-24 mRNA 逐渐升高。说明三七总皂苷能促进骨关节炎大鼠软骨细胞miR-24 mRNA 高表达，进而起到抑制软骨细胞凋亡的作用。

动物实验表明，骨关节炎大鼠软骨细胞C-myc mRNA 和蛋白表达上调[15]。体外细胞试验显示[16]，miR-24 可能下调C-myc 表达，从而抑制骨关节炎的发展。文献报道，C-myc 高表达导致细胞迁移和乳腺癌细胞系侵袭的显著增加；C-myc 能够参与干细胞更新、代谢、生长、增殖、凋亡、血管生成、分化、翻译和核糖体生物发生；miR-24 能够通过结合其3'-UTR 来下调C-myc[17]。本研究结果显示，与骨关节炎软骨细胞组比较，三七总皂苷低、中、高剂量组细胞mRNA 和C-myc 蛋白降低；且随着三七总皂苷剂量的增加，三七总皂苷各剂量组细胞C-myc mRNA 和蛋白逐渐降低。说明三七总皂苷能靶向上调miR-24 mRNA 表达，抑制C-myc mRNA 和蛋白的表达。

综上所述，三七总皂苷能抑制骨关节炎模型大鼠软骨细胞凋亡，促进骨关节炎大鼠软骨细胞增殖；其机制可能与三七总皂苷能靶向上调miR-24 mRNA 进而抑制C-myc mRNA 和蛋白的表达有关。