山茱萸提取物经COX-2/Nrf2 信号通路对脓毒症模型大鼠肝损伤的改善作用

邵 琰 牟微娜 俞莹莹

虽然脓毒症的诊断和治疗已经取得一定进展，但总的死亡率仍然保持在30%～40%左右[1]。在脓毒症的发展过程中，肝脏在清除细菌和产生炎症介质的防御反应中起着重要作用。然而，肝脏也是炎症反应失调的靶点，肝功能障碍预示着更糟糕的结果[2]。以往研究表明，环氧化酶-2（COX-2）/NF-E2 相关因子2（Nrf2）信号通路是免疫防御脓毒症的重要途径，并负责细胞完整性、功能和免疫应答的调节，可以降低感染性损伤的发病率和死亡率[3]。山茱萸是传统中药，有补益肝肾，收敛固涩功效。最新研究表明，山茱萸具有增强免疫和抗氧化活性的作用[4]。本研究探讨山茱萸提取物对脓毒症诱导的大鼠肝损伤的干预作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60 只SPF 级雄性SD 大鼠购自华中科技大学实验动物中心，8～10 周龄，体质量200～230g，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2019-0005，动物使用许可证号：SYXK（鄂）2019-0033，动物质量合格证号：SDYC-201913697，在相对湿度55%，温度25℃，自然光照，自由进食、进水的环境下饲养。本研究经过浙江省台州市中心医院伦理委员会审核备案，批件号：（伦审）202001004 号。

1.2 主要试剂 山茱萸提取物（原料药，纯度99%，西安品健生物科技有限公司，批号77-52-3），将山茱萸提取物和生理盐水配制成浓度分别为：0.4、0.8、1.2g/mL 的溶液；乌司他丁注射液（广东天普生化医药股份有限公司，规格：1mL:5 万U，批号20191209）；苏木精-伊红（HE）染色液、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（上海碧云天生物技术研究所，批号分别为C0107、SF-1437）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和胆红素（BIL）检测试剂盒（中生北控生物科技有限公司，批号分别为E-53820、A127889、JKSJ--1564）；白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（欣博盛生物科技有限公司，批号分别为MM-0670R22、MM-0670R95）；谷胱甘肽（GSH）、髓过氧化物酶（MPO）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为A005、E004-4-12）；蛋白抽提试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号AR0103）；COX-2、Nrf2 和血红素氧化酶-1（HO-1）抗体（美国Santa Cruz 公司，批号分别为sc-52159、sc-39345、sc-58684）；β-actin 抗体、辣根过氧化物酶HRP 标记亲和纯化山羊抗大鼠IgG 二抗（武汉艾美捷科技有限公司，批号分别为C1313、115-035-003）。

1.3 主要仪器 ASP300S 型组织脱水机、EG1150 型包埋机、Leica RM2255 型全自动轮转切片机等病理配套设备（德国Leica 公司）；LV100ND 型显微镜（日本尼康公司）；AU2700 型全自动生化分析仪（日本Olympus 公司）；HBS-1096B 型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；DYCZ-25D 型垂直电泳仪（上海熙浩实业有限公司）；JS-780 型凝胶成像仪（杭州得聚仪器设备有限公司）。

1.4 分组、造模及给药 选60 只成年雄性SD 大鼠适应性喂养1 周后进行实验。应用随机数字表法均分为假手术组、模型组、山茱萸低、中、高剂量组和乌司他丁组，每组10 只。采用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症大鼠模型[5]，操作如下：对所有大鼠进行麻醉，作1cm 长的正中切口，暴露盲肠。模型组、山茱萸低、中、高剂量组和乌司他丁组大鼠将盲肠用3-0 丝结扎，21 号针穿刺2 次，轻轻挤压出少量粪便，重新定位盲肠，然后用3-0 丝线将腹部逐层缝合关腹。假手术组大鼠也进行同样的手术，但不结扎和穿刺。手术后，将大鼠放回笼子里，自由获得水和食物。造模1h后，山茱萸低、中、高剂量组大鼠分别灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物[6]，灌胃体积10mL/kg，同时尾静脉注射2mL 生理盐水；乌司他丁组大鼠灌胃10mL/kg生理盐水同时尾静脉注射乌司他丁10 万U/kg[7]，注射体积2mL；假手术组和模型组大鼠分别灌胃（10mL/kg）和尾静脉注射（2mL）生理盐水，24h 后麻醉，心脏取血，处死大鼠进行相关检测。

1.5 大鼠肝组织病理学观察 取部分大鼠肝组织，用10%甲醛进行固定24h，经脱水、包埋、切片（3μm），进行苏木精-伊红（HE）染色，用光学显微镜观察组织病理学变化。

1.6 全自动生化分析仪检测肝功能指标 将3mL血液以3000r/min 离心15min 分离血清，用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST 和BIL 水平。

1.7 ELISA 法检测肝组织GSH、MPO、IL-6 和TNFα 表达水平 取大鼠肝组织，加入生理盐水（1:10）制成匀浆，5000r/min 离心10min，收集上清液，按照试剂盒说明书检测肝组织GSH、MPO、IL-6 和TNF-α水平。

1.8 蛋白免疫印迹法检测肝组织COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平 取约100mg 大鼠肝组织研碎，根据组织重量加入相应蛋白抽提试剂，冰浴2h，离心后取上清，进行电泳，每孔上样量为30μg，将印迹转移到PVDF 膜上，然后用5%脱脂牛奶在室温下封膜1h，加入COX-2（1:500）、Nrf2（1:500）和HO-1（1:800）和β-actin（1:1000）抗体，4℃孵育过夜，将二抗（1:5000）在室温下孵育30min。用ECL 法进行显色，采集图像，用AlphaEaseFC 图像分析进行分析。

1.9 统计学方法 应用SPSS 23.0 软件进行统计分析。实验数据采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q 检验，P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织病理学比较 假手术组大鼠肝组织未见病理损害；模型组大鼠肝组织见大量炎性细胞浸润，肝细胞水肿和坏死，肝索及肝窦消失；各山茱萸剂量组和乌司他丁组大鼠肝组织可见不同程度淤血、肝窦轻度扩张和炎性细胞浸润，但其损伤程度明显轻于模型组，且山茱萸高剂量组和乌司他丁组无明显差异。见图1。

2.2 各组大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平增加（P均＜0.05）；与模型组比较，各山茱萸剂量组大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平降低，呈剂量依赖性（P均＜0.05）；乌司他丁组和山茱萸高剂量组血清ALT、AST 和BIL 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠肝组织GSH 和MPO 水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠肝组织GSH 水平降低、MPO 水平增加（P均＜0.05）；与模型组比较，各山茱萸剂量组大鼠肝组织GSH 水平增加、MPO 水平降低，呈剂量依赖性（P均＜0.05）；山茱萸高剂量组GSH和MPO 水平与乌司他丁组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.4 各组大鼠肝组织IL-6 和TNF-α 水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠肝组织IL-6 和TNF-α水平增加（P均＜0.05）；与模型组比较，各山茱萸剂量组大鼠肝组织IL-6 和TNF-α 水平降低，呈剂量依赖性（P均＜0.05）；山茱萸高剂量组IL-6 和TNF-α水平与乌司他丁组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表1 各组大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平比较（）

表1 各组大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平比较（）

注：假手术组、模型组灌胃（10mL/kg）和尾静脉注射（2mL）生理盐水；山茱萸低、中、高剂量组分别灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃体积10mL/kg），同时尾静脉注射2mL 生理盐水；乌司他丁组尾静脉注射乌司他丁10 万U/kg（注射体积2mL），同时灌胃10mL/kg 生理盐水；ALT 为丙氨酸氨基转移酶；AST 为天冬氨酸氨基转移酶；BIL 为胆红素；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与山茱萸低剂量组比较，cP＜0.05；与山茱萸中剂量组比较，dP＜0.05

2.5 各组大鼠肝组织COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠肝组织COX-2 蛋白表达水平增加、Nrf2 和HO-1 蛋白水平降低（P均＜0.05）；与模型组比较，各山茱萸剂量组大鼠肝组织COX-2 蛋白水平降低、Nrf2 和HO-1蛋白水平增加，呈剂量依赖性（P均＜0.05）；山茱萸高剂量组COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平与乌司他丁组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4和图2。

图1 各组大鼠肝组织病理学比较（HE×200）

表2 各组大鼠肝组织GSH 和MPO 水平比较（）

表2 各组大鼠肝组织GSH 和MPO 水平比较（）

注：假手术组、模型组灌胃（10mL/kg）和尾静脉注射（2mL）生理盐水；山茱萸低、中、高剂量组分别灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃体积10mL/kg），同时尾静脉注射2mL 生理盐水；乌司他丁组尾静脉注射乌司他丁10 万U/kg（注射体积2mL），同时灌胃10mL/kg 生理盐水；GSH 为谷胱甘肽；MPO 为髓过氧化物酶；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与山茱萸低剂量组比较，cP＜0.05；与山茱萸中剂量组比较，dP＜0.05

表3 各组大鼠肝组织IL-6 和TNF-α 水平比较（pg/mL，）

表3 各组大鼠肝组织IL-6 和TNF-α 水平比较（pg/mL，）

注：假手术组、模型组灌胃（10mL/kg）和尾静脉注射（2mL）生理盐水；山茱萸低、中、高剂量组分别灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃体积10mL/kg），同时尾静脉注射2mL 生理盐水；乌司他丁组尾静脉注射乌司他丁10 万U/kg（注射体积2mL），同时灌胃10mL/kg 生理盐水；IL-6 为白细胞介素-6；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与山茱萸低剂量组比较，cP＜0.05；与山茱萸中剂量组比较，dP＜0.05

3 讨论

脓毒症是肝损伤的早期事件。因此，治疗脓毒症可能为肝损伤的治疗提供重要的辅助作用。乌司他丁是常用抗炎药，但其具有一定的副作用[8]。山茱萸具有调节免疫、抗炎和抗氧化等作用，常用于保肝方面的治疗[9]。

脓毒症期间，促炎性细胞因子的过度释放导致严重的组织损伤和肝损伤。这些细胞因子，特别是TNF-α 和IL-6，在脓毒症诱导的肝损伤中起重要作用，且TNF-α 和IL-6 水平持续升高与预后较差有关[10]。血清AST 水平升高的同时引起肝氧化应激参数的变化。同样，GSH 在防止细胞氧化损伤中也起着重要作用，GSH 水平降低表明氧化应激反应的紊乱。MPO 是嗜中性粒细胞中的一种蛋白质，参与脓毒症患者的早期炎症过程，其在化脓性疾病中的升高，导致肝功能障碍[11]。本研究结果显示，山茱萸提取物能降低脓毒症大鼠血清AST、ALT 和BIL 水平，进而降低氧化应激水平（GSH 水平降增加，MPO 水平降低），抑制炎症因子的释放（TNF-α 和IL-6 水平降低），发挥肝功能保护作用。病理结果显示，模型组大鼠肝组织见大量炎性细胞浸润，肝细胞水肿和坏死，肝索及肝窦消失；各山茱萸剂量组可见不同程度淤血、肝窦轻度扩张和炎性细胞浸润，但其损伤程度明显轻于模型组，也支持了上述推断。

表4 各组大鼠肝组织COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白水平比较（）

表4 各组大鼠肝组织COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白水平比较（）

注：假手术组、模型组灌胃（10mL/kg）和尾静脉注射（2mL）生理盐水；山茱萸低、中、高剂量组分别灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃体积10mL/kg），同时尾静脉注射2mL 生理盐水；乌司他丁组尾静脉注射乌司他丁10 万U/kg（注射体积2mL），同时灌胃10mL/kg 生理盐水；COX-2 为环氧化酶-2；Nrf2 为NF-E2 相关因子2；HO-1 为血红素氧化酶-1；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与山茱萸低剂量组比较，cP＜0.05；与山茱萸中剂量组比较，dP＜0.05

图2 各组大鼠肝组织COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表达

目前已知，脓毒症的病理机制中涉及到COX-2和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）这两种酶[12]。COX-2是一种诱导酶，催化花生四烯酸转化为炎症性前列腺素，在脓毒症中加重炎症反应和损伤器官。已经证明，脓毒症的损伤通过COX-2 的诱导激活巨噬细胞产生前列腺素E2（PGE2）。此外，COX-2 的抑制或缺失可减少内毒素诱导的PGE2，提高脓毒症大鼠的存活率[13]。研究表明，COX-2 在急性肺损伤（ALI）的发展中起重要作用，COX-2 水平随着ALI 严重程度的增加而增加，而COX-2 的抑制减弱ALI 在酸诱导ALI 小鼠模型中的作用[14]。Nrf2 是脓毒症中各种促炎细胞因子表达的重要下游调节因子，通常以灭活的形式存在于细胞质中。当被炎症刺激激活时，它易位至细胞核并启动许多炎症相关基因的表达，例如TNF-α，IL-6，COX-2 和iNOS[15]。在脓毒症诱导的肝损伤患者的各种炎性细胞中已检测到Nrf2 活化被抑制[16]。同时，HO-1 是Nrf2 激活调控的主要抗炎酶，内源性HO-1 在多种应激刺激下广泛表达并高度诱导，在宿主防御过度炎症损伤中发挥重要作用。通过药物或基因转移上调HO-1，可在炎症和免疫反应等多种情况下发挥治疗作用[17]。本研究发现，山茱萸提取物能降低肝组织COX-2 蛋白水平，同时增加Nrf2和HO-1 蛋白水平，从而发挥脓毒症大鼠肝损伤的保护作用。

综上所述，山茱萸提取物可能通过影响COX-2/Nrf2 信号通路，降低脓毒症诱导的大鼠肝组织炎症细胞因子水平，对抗氧化应激，保护脓毒症引起的肝损伤。