结核性气道狭窄中SIRT1对气管成纤维细胞增殖速度及分化的影响研究

蒋源 陈红梅 易恒仲 黄军

支气管狭窄是常见的支气管结核并发症，常见症状为呼吸困难，严重时可引发呼吸衰竭或窒息性死亡[1]。遗传、结核分枝杆菌以及抗结核分枝杆菌的免疫反应，造成成纤维细胞过度增殖、胶原纤维合成增多以及细胞外基质沉积可导致气道狭窄[2-3]。采取有效的措施减少或抑制成纤维细胞增殖和胶原纤维的增加是防治气道狭窄的关键步骤[4]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是NAD+依赖性脱乙酰基酶，在多种疾病的病理进展和治疗中发挥复杂的功能[5-6]。本研究通过检测结核性气道狭窄患者的气道增生肉芽组织中SIRT1的表达，并进一步分析沉默气管成纤维细胞中SIRT1基因表达对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)诱导下的细胞增殖与分化的影响，为结核性气道狭窄的诊治研究奠定基础。

资料与方法

一、 主要材料与试剂

人原代气管成纤维细胞购自武汉Procell公司。胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶和DMEM培养基购自美国 Gibco 公司，Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂盒购自上海慧颖生物科技有限公司，免疫组化染色试剂购自上海古朵生物科技有限公司，Trizol试剂盒、Prime ScriptTM RT reagent Kit试剂盒及SYBR®Premix Ex TaqTM II试剂盒购自日本Takara公司，TGF-β1购自美国PeproTech公司，免疫荧光染色试剂购自上海晶天生物科技有限公司，CCK-8 试剂盒、碘化丙啶、RIPA裂解液、BCA试剂盒、PVDF膜以及ECL发光液购自上海碧云天生物技术有限公司，抗体SIRT1、TNF-α、α-SMA以及辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔购自美国Abcam公司，抗体PCNA、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ以及β-actin购自北京中杉金桥生物有限公司。

二、 标本收集

收集我院2018年5月～2019年12月住院的40例结核性增生性气道狭窄患者的气道增生肉芽组织，作为结核性气道狭窄组，同时取20例正常支气管组织作为正常对照组。所有患者及家属均签署了知情同意书。病例纳入标准：①经支气管镜检查与细菌学确诊的结核性增生性气道狭窄患者；②所有患者均未行抗结核治疗；③正常对照组为在我院体检健康正常者。病例排除标准：①先天性气道狭窄以及气道肿瘤、结缔组织疾病以及其他原因所致气道狭窄者；②耐药结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌及合并人类免疫缺陷病毒感染者；③灌洗液病原菌培养为阳性者；④合并活动性肺结核、合并结核性胸膜炎、淋巴结结核等肺外结核患者；⑤一周内使用激素治疗者。

三、 免疫组化染色

将气道增生肉芽组织置于4%多聚甲醛中固定，采用梯度乙醇脱水，浸于二甲苯中透明，进行常规石蜡包埋，切成4 μm的石蜡切片。组织切片脱蜡至水后，滴加2%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，在高温下进行抗原修复，采用3%H2O2去除内源性过氧化物酶，然后滴加一抗SIRT1(1 ∶200)与TNF-α(1 ∶200)，在4℃ 孵育过夜，次日PBS 冲洗，滴加二抗(1 ∶1000)后在温下孵育1 h，PBS 再次冲洗后，加入DAB进行染核，并使用苏木精复染，采用中性树胶封片，于电镜下观察组织中SIRT1与TNF-α阳性表达，以染成棕黄色至棕色为阳性表达。

四、 细胞培养与转染

气管成纤维细胞复苏后，加入含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)/链霉素(100 μg/mL)双抗液的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱内进行培养。待细胞融合度达到80%时，0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代。将对数生长期的细胞按 4×103个细胞/孔的密度接种96孔板，每组设置5个复孔，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育过夜。实验分为空白对照组、siRNA-NC组、siRNA-SIRT1组，根据Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂盒说明书将siRNA-SIRT1及siRNA-NC序列转染至细胞，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养4 h 后，更换为新鲜培养基，继续培养 48 h后收集细胞。

五、 实时荧光定量PCR

根据TRIzol试剂盒说明提取各处理组气管成纤维细胞总RNA，Nanodrop测定RNA的纯度和浓度。利用反转录试剂盒Prime ScriptTM RT reagent Kit将总RNA进行逆转录合成cDNA，采用SYBR®Premix Ex TaqTM II试剂盒进行qRT-PCR，检测细胞中各基因 mRNA的表达情况，以β-actin为内参基因。扩增条件为：95℃ 3 min，1个循环；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s，42个循环。使用2-ΔΔCt法来计算各基因mRNA的相对表达量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列为：SIRT1上游引物5′-CAAAGGAGCAGATTAGTAGGCG-3′，下游引物5′-CTCTGGCATGCCACTCATAGG-3′， Col-Ⅰ上游引物5′-CATGGTGACAAGGGTGAGAG-3′，下游引物5′- GGATGTTCTCGATCTGCTGG-3′，Col-Ⅲ 上游引物5′-GAATGCCGGAGAAAGAGG-3′，下游引物5′-TCTCGGGTTTCCACACGTCTC-3′，β-actin上游引物5′-ACCAACTGGGACGACATGGAG-3′ ，下游引物5′-TGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3′。

六、 Western blot

在各处理组气管成纤维细胞中加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒对蛋白进行定量。采用10% SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，并转至PVDF膜。使用5%脱脂奶粉在室温下封闭2 h，TBST洗膜后，滴入稀释后的一抗SIRT1(1 ∶1 000)、PCNA(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶2 000)、Col-Ⅰ(1 ∶2 000)、Col-Ⅲ(1 ∶2 000)以及内参鼠抗β-actin(1 ∶5 000)，4℃下孵育过夜。次日，TBST洗膜，然后滴入二抗，置于室温孵育1 h，TBST再次洗膜，并滴加ECL发光液显色曝光， Image Pro Plus分析各蛋白条带灰度值。

七、 CCK-8

将气管成纤维细胞密度调整至5×105/mL，取100 μl接种至96孔板，置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24 h待细胞贴壁后，进行转染实验，转染48 h后，吸去上清。实验设置空白对照组、TGF-β1 组、siRNA-NC+TGF-β1组、siRNA-SIRT1+TGF-β1组。除空白对照组外，其余每孔加入5 ng/mL TGF-β1 刺激48 h，然后更换为100 μL新鲜培养基，分别加入10% CCK-8试剂，放入细胞培养箱中继续培养4 h后取出，采用全自动酶标仪检测各孔光密度(OD)值，检测波长为450 nm。

八、 流式细胞术

将转染48 h并用TGF-β1刺激的气管成纤维细胞用 PBS 洗涤，预冷的75%乙醇重悬细胞，并在-20 ℃下固定24 h，PBS再次洗涤并重悬细胞，每组取 450 μl 细胞悬液，加2 μl RNase后，37 ℃下孵育 10 min，接着加500 μl 碘化丙啶(PI)，置于37 ℃下避光孵育30 min，过300目筛网，通过流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

九、免疫荧光染色

将气管成纤维细胞以 1×104个/孔铺于24孔板内的无菌玻片上，培养 24 h 后，进行转染48 h并用TGF-β1刺激后收集细胞，使用PBS洗涤细胞，加入4%多聚甲醛室温固定15 min，滴加 0.5% TritonX-100 透化处理15 min，然后加入 10%山羊血清室温封闭2 h，滴加稀释的一抗抗体α-SMA(1 ∶150)在 4℃下孵育过夜，次日，弃去一抗使用PBS洗涤后，滴加对应的荧光二抗(1 ∶1000)，室温避光孵育1 h，洗涤并滴加 DAPI染细胞核 10 min，再次洗涤并封片，于荧光显微镜下观察α-SMA表达情况。

十、 统计学分析

结 果

一、 各组支气管组织SIRT1与TNF-α的表达测

免疫组化染色结果(见图1)所示，结核性气道狭窄的气道增生肉芽组织中具有明显的棕黄色至棕色染色，统计结果表明结核性气道狭窄组中SIRT1与TNF-α阳性表达率分别为95.0%(38/40)、97.5%(39/40)，较正常对照组中SIRT1、TNF-α阳性表达率10.0%(2/20)、5.0%(1/20)明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 免疫组化染色检测各组支气管组织中SIRT1与TNF-α的表达(×200)

二、 各组气管成纤维细胞SIRT1 mRNA与蛋白表达检测

qRT-PCR和Western blot 检测结果(见图2、表1)所示，与空白对照组比较，siRNA-SIRT1组气管成纤维细胞中SIRT1 mRNA和蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05)。空白对照组与siRNA-NC 组SIRT1 mRNA及蛋白相对表达水平之间无显著差异(P>0.05)。

图2 Western blot检测细胞SIRT1蛋白表达

表1 各组气管成纤维细胞中SIRT1 mRNA与蛋白表达水平比较

三、 siRNA转染后各组气管成纤维细胞增殖水平比较

CCK-8 实验结果(见表2)所示，与空白对照组比较，TGF-β1组的气管成纤维细胞增殖水平显著增加(P<0.05)。与TGF-β1组比较，siRNA-SIRT1+TGF-β1组细胞增殖水平显著降低(P<0.05)，siRNA-NC+TGF-β1组与TGF-β1组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组气管成纤维细胞吸光度值比较

四、 siRNA转染后各组气管成纤维细胞周期分布

流式细胞术检测结果(见图3、表3)所示，与空白对照组比较，TGF-β1组的气管成纤维细胞G0/G1期细胞比例显著增加，而S期细胞比例显著减少(P<0.05)。siRNA-SIRT1+TGF-β1组较TGF-β1组G0/G1期细胞比例显著减少，同时S期细胞比例显著增加(P<0.05)，siRNA-NC+TGF-β1组各期细胞比例与TGF-β1组各期细胞比例之间无统计学差异(P>0.05)。

表3 各组气管成纤维细胞周期分布比例比较

五、 siRNA转染后各组气管成纤维细胞α-SMA荧光染色比较

免疫荧光染色结果(见图4)所示，TGF-β1组α- SMA 特异性免疫细胞化学阳性染色较空白对照组明显增加。与TGF-β1组比较，siRNA-NC+TGF-β1组α-SMA 特异性免疫细胞化学阳性染色无明显变化，而siRNA-SIRT1+TGF-β1组α-SMA 特异性免疫细胞化学染色阳性明显减弱。

图3 流式细胞术检测气管成纤维细胞周期分布情况

图4 免疫荧光染色检测各组气管成纤维细胞中α-SMA表达(×200)

六、 siRNA转染后各组气管成纤维细胞中PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ蛋白表达比较

Western blot检测结果(见图5、表4)所示，与空白对照组比较，TGF-β1组的气管成纤维细胞中PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ 的蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。siRNA-SIRT1+TGF-β1组PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ 的蛋白表达水平较TGF-β1组均显著下降(P<0.05)，而siRNA-NC+TGF-β1组与TGF-β1组各蛋白表达水平间差异无统计学意义(P>0.05)。

图5 Western blot检测各组气管成纤维细胞中PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ蛋白表达

表4 各组气管成纤维细胞PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ蛋白表达水平比较

七、 siRNA转染后各组气管成纤维细胞中CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表达比较

qRT-PCR检测CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表达水平，结果(见表5)，TGF-β1组的气管成纤维细胞中CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA相对表达水平较空白对照组显著升高(P<0.05)。而与TGF-β1组比较，siRNA-SIRT1+TGF-β1组CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA相对表达水平显著下降(P<0.05)，siRNA-NC+TGF-β1组与TGF-β1组间无统计学差异(P>0.05)(见表5)。

表5 各组气管成纤维细胞CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表达水平比较

讨 论

气道狭窄的特征是气道直径逐渐减小，许多原因引发的气道感染可引起气管或支气管黏膜损伤从而导致异常上皮的再形成，然后正常的气管壁组织被纤维组织所替代，致使气道狭窄的发生[3-4]。这些原因主要包括结核病、真菌感染、细菌性气管炎、组织胞浆菌病以及白喉，其中最常见的是结核病[7]。深入研究结核性气道狭窄的发病机制，发现新的治疗靶点，对于结核性气道狭窄的治疗具有重大意义。

组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase ，HDAC)是一类可催化从组蛋白和非组蛋白中去除N-乙酰-L-赖氨酸氨基酸残基中的乙酰基，并抑制组蛋白乙酰化的酶[8]。Sirtuins是高度保守的NAD依赖的Ⅲ类组蛋白脱乙酰基酶，SIRT1作为研究较为广泛的组蛋白脱乙酰基酶的成员，已有研究表明，SIRT1能够调节肝、胰腺和脑组织中的氧化应激和炎症反应[9-11]。此外，Dvir-Ginzberg等人发现软骨细胞中SIRT1表达水平的升高导致软骨特异性基因聚集蛋白聚糖、2型胶原和9型胶原表达急剧增加，而SIRT1水平降低后则显著抑制了这些基因的表达[12]。Simic等人的研究表明乳腺癌细胞中SIRT1能够负调节上皮细胞间质转型，从而促进癌细胞的凋亡，抑制癌细胞扩散与转移[13]。

本研究通过检测结核性气道狭窄患者的气道增生肉芽组织中SIRT1表达发现，该组织中SIRT1表达异常增高。接着，通过沉默体外培养的气管成纤维细胞中 SIRT1 基因的表达，检测细胞增殖的变化情况，研究结果显示，在转染了SIRT1 siRNA的气管成纤维细胞中，细胞增殖明显受限，G0/G1期细胞比例减少，使得细胞阻滞于S期。PCNA作为反映细胞增殖的标志物，其表达水平的升高表明细胞增殖活跃[14]。本研究结果同样显示，在沉默气管成纤维细胞中SIRT1表达后，细胞中PCNA蛋白表达明显下降。以上结果均表明，沉默SIRT1表达可抑制气管成纤维细胞的增殖速度。

α-SMA是平滑肌细胞的标志物，研究中常用来反映成纤维细胞转化为肌成纤维细胞以及肌成纤维细胞收缩能力的改变，其表达水平升高表明胶原蛋白的合成增加[15]。CoL-Ⅰ与CoL-Ⅲ是肌细胞外间质主要成分，胶原蛋白的表达上调会引起细胞外基质沉积，导致组织功能受损[16]。本研究结果表明，气管成纤维细胞在TGF-β1 诱导下α-SMA、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ表达水平均升高，而在沉默细胞中SIRT1表达后，α-SMA、CoL-Ⅰ及CoL-Ⅲ表达水平降低。此外，本研究检测发现气道增生肉芽组织中TNF-α表达增加，而沉默气管成纤维细胞中SIRT1表达后，TNF-α表达下调。研究表明，TNF-α作为重要的细胞因子参与炎症反应，促进成纤维细胞增殖及分化，并促进细胞外基质合成[17]。这一结果提示沉默SIRT1能够抑制胶原合成和细胞外基质堆积，阻止结核性气道狭窄的发展。

综上所述，本研究揭示了SIRT1在结核性气道狭窄的气道增生肉芽组织中呈现高表达，而沉默气管成纤维细胞中SIRT1表达后，可降低TGF-β1诱导下细胞增殖速度的加快，使细胞发生周期停滞，并抑制细胞的分化。但此过程中的具体作用机制还需进行深入探究，以期为结核性气道狭窄的诊治提供新思路。