纳米载体介导的植物遗传转化研究现状和前景

孙敬爽 胡瑞阳 郑广顺 麻文俊 许言 王军辉

（1. 中国林业科学研究院华北林业实验中心 楸树国家创新联盟 北京 102300；2. 林木遗传育种国家重点实验室 国家林草局森林培育重点实验室 楸树国家创新联盟 中国林业科学研究院林业所 北京 100091）

遗传转化是植物功能基因组研究和分子育种的核心工作之一，发展高效、安全的新型遗传转化方法，一直是基因工程、分子生物学和遗传育种等领域的研究热点之一［1］。传统的植物遗传转化方法，主要通过根癌农杆菌侵染、基因枪轰击和病毒侵染等转化方法获得转基因植株。目前已经广泛应用于拟南芥、烟草等模式植物和一二年生草本植物或园艺植物。但对于木本植物或顽拗型基因型的植物来说，仍存在遗传转化技术难题，获得转基因植株仍非常困难。例如，林木转基因研究主要集中于杨树（Populus tremula×Palba.）［2］、火炬松（Pinus taeda）［3］、刺槐（Robinia pseudoacacia）［4］、白云杉（Picea glauca）［5］、白桦（Betula platyphylla）［6］、落叶松（Larix gmelinii）［7］等20 多个树种。大多数林木中克隆的功能基因只能转化到拟南芥和烟草等模式植株中进行分析验证，从而严重限制了植物分子育种以及基因功能的有效研究。

随着纳米技术的发展，纳米粒子作为基因载体已广泛应用于动物细胞、医学领域和基因治疗等领域［8-10］。因纳米载体具有大比表面积可高效负载基因、生物兼容性强可保护负载基因、毒性小安全性高等特点［11-12］。2007 年，Torney 等［13］首次利用介孔氧化硅纳米载体装载基因转化烟草细胞并获得成功，实现了纳米载体介导基因在植物细胞的转化，并逐渐发展成为一类具有创新性的高效植物转基因技术［14-15］。本研究根据纳米粒子特性介绍已应用于植物遗传转化的纳米基因载体类型、与外源基因的结合方式及传输细胞的原理，并重点介绍影响纳米载体性能的因素以及转化植物的方法，分析了与早前转基因方法的区别和优势，并对纳米载体介导外源基因转化存在的问题和发展前景进行了探讨，期望为植物遗传转化技术和方法提供新的思路。

1 纳米基因载体

纳米基因载体是一类由生物兼容性性材料通过分子自组装的方法制备而成，用于运载基因的纳米微囊或纳米粒子的总称［16］。通过纳米载体表面修饰相应基团，使其以物理或化学亲和作用包裹或吸附外源DNA 等核酸分子，从而形成纳米基因载体复合物，通过化学键或静电吸附作用与细胞表面受体结合，利用细胞胞吞作用实现基因的靶向运输［17］。

1.1 纳米基因载体的分类

纳米基因载体从形态特征上分为纳米粒、纳米球、纳米囊、纳米孔及纳米片层等多种形态；从材料来源可以分为无机物纳米材料、天然高分子纳米材料和有机合成高分子纳米材料等［18］（图1）。

目前应用于植物遗传转化的纳米基因载体以无机物纳米材料为主（表1），包括以四氧化三铁（Fe3O4）构建的磁性纳米粒子（Magnetic nanoparticles，MNP），以二氧化硅骨架构成的介孔二氧化硅纳米载 体（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）， 以碳原子构成的单壁碳纳米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳纳米管（Multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）等纳米材料构成的纳米载体。无机物纳米材料制作简单，可在水溶液中通过共沉淀或氧化共沉淀制备，合成重复性好，并根据反应条件调节纳米颗粒的粒径大小、形状和组成；且无机纳米材料作为基因载体具有生物亲和性好、免疫排斥反应低、降解后毒副反应小，可有效保护核酸免受核酸酶的降解等优势［19-20］。

其次以壳聚糖（Chitosan，CHS）、淀粉（Starch nanopaticls，StNP）和细胞穿膜肽（Cell penetrating peptides，CPPs）的天然高分子材料制备的纳米载体，以及由磷酸钙（Calcium phosphate，CaP）、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（Dimethylaminoethyl methacrylate，DMAEM）聚合物、聚酰胺型树枝状聚合物（Polyamidoamine，PAMAM）、多聚赖氨酸（Poly-l-lysine，PLL）、聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）等人工合成的高分子材料作为植物基因载体也有少量应用［21］。天然高分子有机纳米材料来源容易，具有无毒抗菌、生物相容性好及生物易降解等特点；合成的高分子有机纳米材料合成制备相对容易，可规模化生产，具有良好的分散性、易于表面修饰、穿透膜能力强等优势。

1.2 纳米基因载体与DNA等核酸的结合方式

纳米粒子的小尺寸效应，大比表面积效应以及表面较强的物理化学活性使其能够负载多种不同类型的核酸分子，如DNA、siRNA、miRNA、dsRNA、蛋白和核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）等［22］。无机类纳米粒子可以直接结合DNA 等核酸分子，但由于负载效率低，需要对其化学结构进行阳离子聚合物或氨基硅烷化修饰，才能有效吸附与运输核酸分子。例如，介孔二氧化硅纳米载体是在多孔硅纳米颗粒或者壳-核型中空二氧化硅表面经过表面氨基化，通过化学偶联作用与核酸分子形成纳米载体基因复合物［23］；磁性纳米载体可以通过表面改性与多种功能基团修饰，如-NH2、-CHO、-COOH 和-OH等，使纳米载体能够通过静电作用、化学偶联作用、配体反应等物理或化学亲和方式负载结合核酸分子［24-25］。而有机高分子形成的纳米粒子，由于其表面负载氨基而带正电荷，可以直接与带负电荷的DNA 等核酸分子通过静电吸附作用结合，使核酸分子由蓬松与分散状态浓缩至纳米颗粒中，形成体积小、形状规则的纳米基因载体复合物［26-27］。

图1 应用于植物或动物外源基因转化的常见纳米粒子（引自［41］）

1.3 纳米基因载体复合物传输细胞的原理

目前，纳米作为基因载体传输细胞的原理研究还相对较少。纳米载体基因复合物主要通过3 种途径穿越植物细胞壁屏障：（1）通过一定的外力在细胞上形成可逆的瞬间通道，使纳米载体基因复合物直接进入细胞内部［13，28］；（2）利用纳米粒子的功能修饰，如利用带阳离子肽聚合物的修饰，与细胞壁上受体的相互作用来扩大细胞壁的孔径以提高纳米粒子的摄入［29］；（3）纳米载体基因复合物利用细胞壁的孔隙直接通过细胞壁，如花粉粒的花粉孔、叶片气孔保卫细胞孔隙［30］。

跨越细胞壁后，纳米载体基因复合物主要是通过细胞的胞吞作用进入细胞。纳米载体基因复合物表面多余的电荷使其以被动的形式快速黏附在细胞膜表面，继而通过细胞的胞吞作用或摄取作用进入细胞［31］。细胞膜内陷形成内含体包裹纳米载体基因复合物，并被细胞内的溶酶体吞噬［32］。在溶酶体内，纳米载体上的阳离子基团不断置换质子，抑制pH 降低，使质子不断泵入溶酶体，导致溶酶体裂解，最终纳米载体基因复合物通过质子-海绵效应的过程逃逸出溶酶体，释放在细胞胞浆内［33］。但也有研究认为，一些纳米粒子，如LDHs 负载外源基因通过非胞吞作用进入细胞，典型的内吞抑制剂和低温孵育不能阻止LDHs 的内吞，LDHs 是直接跨越细胞膜进入细胞内，这种特性可能拓宽其在多种植物中的应用［34］。

从溶酶体释放的纳米载体基因复合物扩散到核膜表面，有两种情况从核孔进入细胞核，一种是纳米载体与核酸分子在细胞核外解离，核酸分子单独进入细胞核；另一种是纳米载体基因复合物进入细胞核，在细胞核内部解离，核酸分子与植物细胞的基因发生重组［35-37］；然而对于纳米载体介导的外源基因进入核细胞与染色体的整合情况，如外源基因的拷贝数与整合位点等方面研究仍不清楚，是否类似于根癌农杆菌介导的T-DNA 与染色体基因组的整合机理，目前还未见报道。

表1 介导植物遗传转化的纳米载体类型、特性、功能修饰、转入植物细胞途径及基因表达情况

表1 续表

2 影响纳米基因载体性能的重要因素

纳米载体的粒径、形状、表面电荷、修饰的功能基团以及细胞内部环境等都会影响其负载外源基因、细胞摄入和基因表达效率的重要因素［38-39］。

2.1 纳米载体粒径

纳米载体的粒径是影响外源基因转化效率的重要因素。不同于动物，植物具有细胞壁这一天然屏障，纳米载体负载外源基因转化细胞核或原生质体需要通过细胞壁和质膜等屏障。植物细胞壁排除外源物的极限为5-20 nm［40］，植物细胞、细胞核或细胞膜的限制范围为300-500 nm，阻止较大的外源分子进入［41］。纳米粒子是一类一维粒径至少小于100 nm 的物质，然而研究表明纳米粒径在20-100 nm 范围内，具有较强的穿透性，既有利于纳米粒子携带外源基因，经细胞摄取而进入细胞内部，又不因过小而被过滤清除掉［42］。

2.2 纳米载体结构

纳米载体结构不同，负载外源基因的形式不同。如球状纳米载体，外源基因一般负载在表面；多孔纳米载体，外源基因多数负载在其孔内；层状纳米颗粒，外源基因负载在其片层内等。目前，不同类型的纳米负载外源基因的效果，以及外源基因传输细胞与转化效率未见系统的比较。但有研究发现，以siRNA 作为外源基因，不同纳米结构形成的纳米载体复合物转入细胞的效率与细胞内基因沉默的效果相关，siRNA 负载在三维结构纳米载体中，能够使内源基因在转录水平和蛋白水平都沉默。但是负载在一维结构纳米载体中，只会使其在蛋白水平上发生沉默而在转录水平却得到了提高，说明纳米不同结构转入外源基因的原理可能不同［43］。

2.3 纳米载体表面修饰

纳米粒子富有活性的化学结构可以直接结合核酸分子，也可以通过不同基团修饰后再结合核酸分子，形成纳米载体-基因复合物［44］。纳米粒子经亲水性物质（如聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸等）表面修饰后，可以提高其在分散体中稳定性，增加与细胞膜的结合力［37，45-46］；经过糖类物质（如壳聚糖、环糊精等）修饰的纳米粒子，能增加纳米载体对基因的负载量，增加复合物电位值Zeta，提高穿越细胞膜等生物屏障能力，并且提高转基因的靶向性［47-48］。例如，以羧基化壳聚糖负载的CSCOVSWNTs 负载外源基因进行烟草植物细胞转化，与其他修饰SWNTs 相比，CSCOV-SWNTs 不仅具有更多可用的壳聚糖链负载基因，而且CSCOV-SWNTs 具有更高的C-C 共价键（～88 kcal/mol），电位Zeta（37.6 mV）明显高于其他修饰，可以安全地携带外源基因通过生物屏障和细胞膜，进入细胞核内部，提高转化效率［49］。另外，纳米粒子在经表面活性剂（如葡聚糖、聚山梨脂和胆固醇等）修饰后，也可以保护外源分子免受降解，提高细胞对纳米载体摄取效率［50］。

2.4 环境条件

尽管大多数纳米粒子与外源基因结合方式比较温和，在室温条件下（25-35℃）孵育15-30 min 即可结合形成纳米载体基因复合物［24，49，51］。但研究发现，纳米载体基因复合物转染效率是与其浓度、共孵育温度、时间及pH 相关。在一定范围内增加纳米载体基因复合物浓度，延长与悬浮细胞的共培养时间，都可以有效增加外源分子在植物细胞的转染效率；植物细胞摄取纳米载体依赖一定温度条件，研究发现在4℃条件下共培养，即使共孵育时间延长24 h 细胞内部也没有纳米粒子负载的荧光信号［52］；另外，利用植物细胞内不同结构的 pH 差异可以实现靶向转基因，植物细胞质pH 值在5.5 左右，而叶绿体的pH 在8.0 左右［53］，研究发现以壳聚糖修饰的单壁碳纳米管设计为在细胞外弱酸条件，pDNA 可以与单壁碳纳米管紧密结合，而在叶绿体弱碱环境中，pDNA-SWNT 的结合能力明显减弱，可以使pDNA 在叶绿体中有效释放，从而实现纳米载体负载外源基因在叶绿体质体的靶向转基因［49］。因此，如何通过利用植物细胞不同结构的pH 差异设计纳米载体，实现靶向转基因是今后重要研究方向。

3 纳米载体-基因复合物的在植物细胞中的转化方法

目前利用纳米粒子形成的纳米载体-基因复合物，通过磁转染、PEG 转染等外力以及直接转化的方式，将外源基因转入玉米胚［13］、盾叶薯蓣愈伤组织悬浮液［46］、芥菜、烟草原生质体或叶子［54］和拟南芥根［26，55］等多种植物组织或器官（表1）。

3.1 借助外力转化方法

借助合适的载体和外力可以提高纳米载体-基因复合物进入细胞核的数量［14］，易形成稳定的植物遗传转化（表1）。Torney 等［13］4 位博士利用蜂窝状介孔二氧化硅纳米粒子为载体，利用基因枪方法将外源基因转入植物细胞中，并在细胞中适当的时间和地点释放，成功获得了转基因植株。利用电击法直接在植物细胞壁上穿孔，Fe3O4磁性纳米粒子负载DNA 导入水稻悬浮细胞，该方法既保护了DNA分子免受电击、酶解的破坏，又提高了植物细胞的存活率［56］。Zhao 等［25］利用Fe3O4磁性纳米颗粒的超顺磁性，在磁场的定向驱动作用下，纳米载体复合物通过花粉孔将外源BtΔα·Cpti基因转入棉花花粉，而花粉生活力没有改变，并通过杂交授粉获得转基因棉花。以多聚赖氨酸修饰的淀粉纳米粒子作为基因载体，将外源基因通过超声波介导法转入盾叶薯蓣细胞，实现基因的遗传转化［57］。

3.2 直接转化方法

研究表明纳米载体携带外源基因也可直接转化植物细胞。其中以碳原子构成的单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、碳纳米点等作为纳米载体已经成为实现完整植株遗传转化的热门材料，转化方法简便，转化效率高，但多以瞬时转化为主。例如，利用壳聚糖修饰的单壁碳纳米管（CSCOV-SWNT）为载体，以叶片注射的方式将外源基因转入烟草、芥菜等植物叶绿体质体基因组［49］。siRNA 可以通过单壁碳纳米管载体有效地转化到烟草叶子，沉默外源基因的效率达95%，并且研究发现基因沉默效率取决于纳米基因载体复合物颗粒的大小，性状、紧实度及siRNA 负载的位点［58］。美国加州大学伯克利分校通过制备聚乙烯亚胺功能化的单壁碳纳米管（SWNTPEI），通过叶片直接浸染可以瞬时转化完整烟草植株，从单壁碳纳米管功能修饰到转基因表达只需5 d［37，59］。英国布里斯托大学的Whitney 团队利用合成的碳纳米点材料（Carbon dots，CD）包被含有Cas9 和gRNA 的质粒，通过直接喷洒叶片实现了SPO11基因的编辑［60］。此外，多层双金属氧化物也是近年来发展的直接植物细胞转化的重要载体［34］。Bao 等［55］用LDHs 负载荧光分子、小片段双链DNA，通过浸染方式成功转入拟南芥根表皮、叶肉表皮细胞及烟草悬浮细胞。Mitter 等［61］利用LDHs纳米材料负载植物抗病毒干扰RNA，通过叶面喷洒实现了在植物叶面的长效递送。

4 纳米载体介导的植物遗传转化的技术优势

传统的植物遗传转化方法主要为农杆菌侵染法、基因枪法和病毒载体介导法。自1983 年获得第1 例以农杆菌介导的转基因烟草以来，植物转基因技术迅猛发展，目前已经有百余种转基因植株问世，其中80%是以农杆菌介导法转化植株。但由于农杆菌转化过程中受到基因型和宿主范围限制、组培再生以及转化感受态细胞不一致等问题，使许多植物，尤其是多年生林木树种的遗传转化受到限制［77］。基因枪转化法虽然不受植物物种限制，但需要昂贵的专用设备，而且高轰击压力易造成组织损坏［78］，需要提供一定量的外源基因才达到预期的转基因效率，研究报道以SWNT 作为载体介导植物遗传转化所用pDNA 只有20 ng，而基因枪转化则需要5 μg［79］。病毒载体介导法虽转染效率高、应用范围广，但更适宜于基因敲除、基因沉默等反向遗传学研究，属于瞬时表达技术，受宿主载体的局限性明显［80］。

纳米载体介导的转基因技术，是一项纳米技术与生物技术交叉融合的新型转化技术［17，81］。纳米载体介导转基因技术具有明显的优势：（1）纳米载体体积小，大比表面积，易于化学基团的功能修饰，可以高效负载外源基因，提高转化效率；（2）纳米粒子的结构特性能够保护负载基因免受DNase Ⅰ酶解，保证外源基因在细胞内的稳定转化；（3）纳米载体利用纳米粒子小体积效应、可调节的物理和化学特性使其通过植物细胞壁的屏障进入细胞内部，基本不受植物基因型和宿主范围限制；（4）纳米载体介导外源基因转化，反应条件温和，操作简单，转化所需时间短，对植物生长发育无影响；（5）纳米材料种类多样，粒径大小和结构类型易于变化、易于不同功能基团和荧光标记修饰，可形成多种不同类型的纳米载体用于植物遗传转化。

5 纳米粒子介导的植物遗传转化面对的问题和应用前景

5.1 瞬时转化与稳定表达

尽管目前报道的以纳米载体介导的转基因技术，可以实现外源基因在叶片或叶肉细胞等部位的表达，但研究多以GFP、GUS 或RNAi片段为外源基因的瞬时转化为主，如何将纳米载体介导的转基因进一步应用于植物，获得转基因植株，需要进一步扩大目的基因，优化转化方法、扩大转化受体细胞或组织的筛选，从而实现功能基因高效稳定转化获得转基因植株，建立纳米载体介导的简单、快捷、高效稳定的植物遗传转化体系。

5.2 纳米载体介导的基因编辑技术

锌指核酸酶（Zinc fingernucleases）和CRISPRassociated protein 9（Cas9）目前已经成为重要的基因编辑工具，尤其是CRISPR-Cas9 已经在水稻、番茄、高粱、小麦和棉花成功实现性状改变［82］。CRISPRCas9 基因编辑的全方位和易操作性使其成为研究植物基因型-表现型对应关系的重要工具。然而CRISPR-Cas9 基因编辑也面临着遗传转化中植物细胞壁屏障转化受体的限制［83］，尽管有少量研究报道可以通过基因枪转入原生质体和体胚［84-85］。目前已经实现碳纳米点载体介导的植物体内的瞬时基因编辑，为纳米载体与基因组编辑工具结合起来提供一个良好的机会［37］。今后应利用纳米载体介导的瞬时转化，实现基因的瞬时沉默或增强基因表达，进一步开展植物发育研究与重要基因功能鉴定；另一方面应探索纳米载体介导的稳定、靶向性的基因编辑技术体系，实现植物品种改良。

5.3 纳米载体介导的植物原位转基因方法的探索

植物原位转化方法是一种不需要植物组织或细胞培养手段，而使植物在活体（in vivo）而非离体（in vitro）状态下的转化，能够避免植物组织培养产生的无性系变异和部分植株基因型难于进行组织培养的优点［86］。纳米粒子具有大比表面积、体积小、穿透性强的特性，通过注射、喷施及浸染等方式已实现了外源基因在完整植株叶片的转染，如何利用纳米粒子特性，进一步发展纳米载体介导的植物原位转基因技术，一方面发展不依赖组培再生的转基因技术，突破顽拗型植物基因型或种类的遗传转化技术难题；另一方面以纳米载体介导不同株龄植株的遗传转化，根据时空需要进行基因表达调控研究可能将是林业发展的又一种重要方向。