黄芪多糖下调心肌p38和核因子κB的磷酸化改善老年糖尿病鼠心脏功能

孙奇林，陈雯洁，赵雪兰，王浩，陈蔚

1.复旦大学附属华山医院老年科，上海200040；2.复旦大学基础医学实验教学中心，上海200032

糖尿病（diabetes mellitus,DM）是影响人类健康的慢性疾病之一，DM 的患病率随年龄增长而升高，约20%的老年DM 患者合并心血管并发症[1]。与非DM 心血管病患者相比，老年DM 心血管病患者心力衰竭的发病率可增加3 倍[2-3]，已成为老年DM 患者的主要死因之一[4]。

老年DM 心血管病的发病机制复杂。近年来的研究发现，心肌纤维化在老年DM 患者病程早期就已出现，是促进老年DM 心血管病发生及进展的重要环节[5]。在老年DM 状态下，心肌细胞和心脏成纤维细胞可被诱导分泌白细胞介素-1（interleukin-1,IL-1）、IL-6 及转化生长因子-（transforming growth factor-,TGF-）等多种促纤维化因子，合成细胞外基质（I 和III型胶原），升高细胞外基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1,MMP1）、MMP3 和MMP9 的表达，引发细胞外基质合成与降解失衡、心肌胶原纤维过度沉积，造成心肌纤维化和心室重构，最终导致心功能下降及心力衰竭[6-7]。黄芪多糖（astragalus polysaccharides,APS）是黄芪的均一多糖部分，为黄芪主要的活性成分之一。课题组前期研究证实，APS 可以改善DM 鼠的心脏功能，保护其心肌组织[8-9]。本研究拟在此基础上，进一步探讨APS 对老年DM 鼠心肌纤维化的干预作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂 链脲佐菌素（streptozocin,STZ,美国Sigma）；APS（中科院上海生理所）；糖化血清蛋白（glycosylated serum protein,GSP）试剂盒（美国Genzyme）；BCA 试剂盒（美国Thermo Fisher）；聚偏二氟乙烯膜（美国Millpoler）；I 型胶原多克隆抗体（美国ADI）；III 型胶原多克隆抗体（复旦上医病理学系）；羊抗兔二抗（丹麦DAKO）；MMP1 抗体、MMP3抗体、MMP9 抗体、IL-抗体、IL-6 抗体、TGF-抗体、胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）1/2 抗体、Jun 激酶（Jun kinase,JNK）抗体、p38 丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activation proteinkinase,MAPK）抗体、核因子（nuclearfactor-,NF- B）/p65 抗体、GAPDH 抗体（英国Abcam）。

1.1.2 主要仪器 小动物彩色超声诊断仪（加拿大VisualsSonics）；微量血糖测试仪（德国Bayer）；超薄切片机（澳大利亚Leica）；分析天平（德国Sar-torius）；组织研磨仪（美国Qiagen）；垂直电泳槽、蛋白电泳仪（美国Bio-rad）；凝胶成像系统（美国Applied Biosystems）；台式冷冻高速离心机5427R（德国Eppendorf）。

1.2 实验动物 18月龄SPF 级自然衰老的雄性C57-BL/6J 小鼠30 只[上海南方模式生物科技发展有限公司，合格证号：SCXK（沪）2014-0002]，饲养于复旦大学医学院实验动物科学部。饲养期间每日12 h 光照，小鼠自由饮水和摄食。

1.3 动物分组与干预 30 只小鼠按照随机数字法分为对照（NS）组、老年糖尿病（DM）组和老年APS组，每组10 只。老年DM 组和老年APS 组单次腹腔注射STZ（100 mg/kg）[10]；NS 组注射等体积生理盐水。小鼠糖尿病模型建立成功后，老年APS 组予APS 2 g/kg/d 灌胃16 周[11]，NS 组和老年DM 组予等体积生理盐水灌胃16 周。

1.4 检测指标

1.4.1 心脏功能及血流动力学 小鼠麻醉后，使用小动物彩色超声诊断仪获取超声心动图。记录左心室短轴缩短率（leftventricularfractionalshortening,LVFS）、左心室收缩压（left ventricular systolic pressure,LVSP）、左心室舒张末期压（left ventricular end diastolic pressure,LVEDP）、左室内压最大上升速率（maximal change of pressure over time,+dP/dtmax）及左室内压最大下降速率（maximal change of pressure over time,-dP/dtmax）。

1.4.2 血糖和心肌酶谱 干预16 周后，剪尾采血法测定各组小鼠空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）。颈椎脱臼法处死小鼠，眼球取血后离心取上清，全自动生化仪检测GSP、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、肌酸激酶（creatine kinase,CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes,CK-MB）及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）水平。

1.5 心肌胶原纤维化评估 心肌组织制作石蜡切片，HE染色观察心肌组织病理变化，Masson 染色评估心肌纤维化程度。免疫组化法检测I、III 型胶原纤维含量及比值，每组随机选取5 个显微镜下无重叠的视野，通过Image J 对染色阳性物质进行灰度测定。

1.6 Western blot 取心肌组织匀浆裂解，BCA 法测定蛋白含量，SDS-PAGE 电泳分离法将蛋白转膜，5%脱脂乳封闭后与相应兔抗鼠一抗4℃孵育过夜，TBTS洗膜后加入HRP 标记的羊抗兔二抗孵育1 h，洗去二抗后ECL 显色成像。以GAPDH 为内参，检测目的蛋白相对表达水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0 进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。多组比较采用单因素方差分析，事后检验经Bonferroni 校正法得2 组间检验结果，<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血糖和心肌酶谱比较 与NS 组相比，老年DM 组和老年APS 组BG、GSP、AST、CK、CK-MB 及LDH升高（均<0.01）。与老年DM 组相比，老年APS 组BG、GSP、CK 和CK-MB 降低（均<0.01），2 组AST 和LDH 差异无统计学意义（>0.05）。见表1。

表1 3 组血糖和心肌酶谱比较（±s）

表1 3 组血糖和心肌酶谱比较（±s）

注：与NS 组比较，*<0.01；与老年DM 组比较，#<0.01

项目 NS 组 老年DM 组 老年APS 组images/BZ_201_1716_1719_1740_1744.pngimages/BZ_201_2050_1719_2074_1744.pngBG（mmol/L）GSP（ mol/L）AST（U/L）CK（U/L）CK-MB（U/L）LDH（U/L）6.05±0.18 22.94±2.23 77.80±1.30 64.80±1.20 101.70±2.96 0.14±0.01 24.73±2.08*135.85±8.10*222.03±9.40*387.30±7.30*608.00±8.71*0.64±0.02*15.94±1.42*#85.91±4.20*#194.82±8.20*166.22±6.10*#339.00±6.98*#0.47±0.01*648.600 566.200 798.500 14 174.000 16 538.000 5 271.000<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

2.2 心脏功能和血流动力学比较 与NS 组相比，老年DM 组LVFS、LVSP、+dP/dtmax 及-dP/dtmax 降低；LVEDP 升高（均<0.01）。与老年DM 组相比，老年APS 组LVFS、LVSP、+dP/dtmax 及-dP/dtmax 升高；LVEDP 降低（均<0.01）。与NS 组相比，老年APS组LVFS、LVSP 和-dP/dtmax 降低（均<0.01），2 组LVEDP 及+dP/dtmax 差异无统计学意义。见表2。

表2 3 组心脏功能和血流动力学比较（±s）

表2 3 组心脏功能和血流动力学比较（±s）

注：与NS 组比较，*<0.01；与老年DM 组比较，#<0.01

项目 NS 组 老年DM 组 老年APS 组images/BZ_201_1819_2275_1843_2300.pngimages/BZ_201_2085_2275_2109_2300.pngLVFS（%）LVSP（mmHg）LVEDP（mmHg）+dP/dtmax（mmHg/s）-dP/dtmax（mmHg/s）64.00±4.30 97.00±3.30 7.80±1.10 8 197.00±471.00 6 851.00±333.00 36.00±1.15*75.00±1.72*13.10±2.10*5 828.00±236.00*4 706.00±227.00*56.00±1.90*#94.00±2.60*#7.60±0.90#8 129.00±438.00#6 489.00±310.00*#447.300 343.400 61.190 69.870 247.400<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

2.3 心肌胶原纤维化比较 与NS 组相比，老年DM 组心肌组织结构紊乱，胶原纤维明显沉积，I 型胶原纤维含量和I/III 型胶原纤维比值升高（均<0.01）。与老年DM 组相比，老年APS 组心肌组织排列紊乱现象好转，胶原纤维沉积减少，I 型胶原纤维含量和I/III 型胶原纤维比值降低（均<0.01）。NS 组与老年APS组胶原纤维含量差异无统计学意义。见表3、图1。

图1 3 组心肌病理HE 染色和心肌胶原纤维Masson 染色（×400）

表3 3 组心肌胶原纤维化比较（±s）

表3 3 组心肌胶原纤维化比较（±s）

注：与NS 组比较，*<0.01；与老年DM 组比较，#<0.01

项目 NS 组 老年DM 组 老年APS 组images/BZ_201_1807_2773_1831_2798.pngimages/BZ_201_2081_2773_2105_2798.pngI 型胶原纤维含量III 型胶原纤维含量I/III 型胶原纤维比值3.65±0.23 1.52±0.11 2.12±0.07 5.46±0.29*1.85±0.13 2.67±0.22*3.92±0.14#1.64±0.07 2.14±0.11#240.500 13.910 48.030<0.01<0.01<0.01

2.4 MMPs 和促纤维化因子蛋白表达 与NS 组相比，老年DM 组心肌细胞外MMP1、MMP3、MMP9、IL-1 、IL-6 和TGF- 蛋白表达增多（均<0.01）。与老年DM 组相比，老年APS 组心肌细胞外MMP1、MMP3、MMP9、IL-1 、IL-6 和TGF-蛋白表达减少（均P<0.01）。与NS 组相比，老年APS 组MMP3（P=0.018）及IL-1 、IL-6、TGF-（均P<0.01）蛋白表达增多，2 组MMP1 和MMP9 差异无统计学意义。见图2。

图2 3 组MMPs 和促纤维化因子蛋白表达比较

2.5 MAPK 的蛋白磷酸化水平 与NS 组相比，老年DM 组心肌ERK1/2、JNK、p38 MAPK 及NF-/p65蛋白磷酸化水平升高（均<0.01）。与老年DM 组相比，老年APS 组心肌p38 MAPK 及NF- B/p65 蛋白磷酸化水平降低（均<0.01），2 组ERK1/2 和JNK的蛋白磷酸化水平差异无统计学意义。与NS 组相比，老年APS 组ERK1/2、JNK 及p38 MAPK 蛋白磷酸化水平升高（均<0.01），2 组NF- B/p65 蛋白磷酸化水平差异无统计学意义。见图3。

图3 3 组ERK1/2、JNK、p38MAPK 和NF- B/p65 磷酸化表达

3 讨论

老年DM 心血管病的发病机制复杂，公认的经典机制包括心肌能量代谢障碍、氧化应激、慢性炎症、胰岛素抵抗和心肌纤维化等。目前认为心肌纤维化是老年DM 心血管病的重要发病机制之一[12]。心肌纤维化导致心肌广泛性坏死、间质纤维化、心室重构及心功能不全等一系列老年DM 心血管病病理过程，最终引发老年DM 患者的充血性心力衰竭[13-14]。

黄芪主治气虚，多用于DM 患者心功能不全的配伍治疗，临床观察确有疗效而机制不明[15]，APS 是黄芪主要的有效活性成分之一[16]。本次研究发现，APS干预治疗后老年DM 组心肌酶谱恢复正常，心脏功能改善，血流动力学紊乱得以纠正，提示APS 对老年DM 鼠心血管病有一定的保护作用。APS 干预后，老年DM 鼠的心肌IL-、IL-6、TGF-、MMP1、MMP3和MMP9 蛋白表达减少，I 型胶原纤维含量和I/III 型胶原纤维比值恢复正常，说明APS 可以延缓老年DM鼠心肌纤维化的发生与发展，对老年DM 鼠心脏功能起到有效的保护作用。进一步研究发现，老年DM 鼠心肌ERK1/2、JNK、p38 MAPK 及其下游基因NF-/p65 的蛋白磷酸化水平增高，而APS 可以降低p38 MAPK 及NF-/p65 的蛋白磷酸化水平。考虑该现象可能与p38 MAPK/NF-信号通路调控的生理过程相关。

p38 MAPK 作为一类酪氨酸磷酸化蛋白激酶，与心肌胶原沉积及纤维化的调控关系密切[17]。而NF-是p38 MAPK 下游重要的转录调控因子，其表达活性受p38 MAPK 的正调控。研究表明，p38MAPK/NF-B 信号通路的激活是心血管疾病和心肌纤维化反应链的“基因开关”[18-19]。此次研究结果也支持这一理论。目前认为持续的高血糖能激活心肌p38 MAPK/NF-信号通路，诱导心肌细胞和心脏成纤维细胞分泌炎症细胞因子，合成炎性蛋白和炎症介质，从而介导老年DM 心血管病的心肌纤维化[20]。

综上所述，APS 可能通过下调老年DM 鼠心肌p38 MAPK 及其下游基因NF-的蛋白磷酸化水平，减少老年DM鼠心肌促纤维化因子蛋白和心肌细胞外MMPs 的蛋白表达，抑制心肌I 型胶原纤维过度沉积和I/III 型胶原纤维比例失调，延缓心肌纤维化发生、发展，从而对老年DM 心脏功能起到保护作用。但APS延缓DM心肌纤维化的具体分子机制尚有待进一步研究，未来将进行体内外实验深入探讨APS 对DM心肌纤维化的抑制作用及其机制。