老年细菌性肺炎纤维支气管镜吸痰样本的菌群分布特征

胡江，穆汇，周奇兴，邹盈，陈茹艳，赵虎

1.上海普陀区利群医院检验科，上海200333；2.上海普陀区利群医院呼吸科，上海200333；3.复旦大学附属华东医院检验科，上海200040

肺部感染在各类感染疾病中的比例较高，尤其以老年患者更容易发生呼吸道感染。据推测，下呼吸道感染与呼吸道菌群变化之间可能存在密切关系。以往人们认为健康人肺部是无菌的，并且对呼吸道菌群的研究也主要是依赖传统的细菌培养技术。在过去的十多年间，高通量DNA 测序技术经过不断完善，已经发展成为一个高效而精准的强有力的工具，大大促进了基础和临床各方面研究的突飞猛进。近年来，将该技术应用于呼吸系统的微生物学研究之后，发现健康人肺部存在复杂的微生物群。但是，采用该技术深入研究疾病状态下呼吸道菌群的变化，目前国内外尚未见有报道。

本研究比较了高通量DNA 测序技术与传统的痰涂片和培养方法，检测老年肺炎患者痰样本中的菌群分布，发现这些患者的下呼吸道都具有丰富的细菌种类；并且16s rDNA 高通量测序方法相较传统的检测技术更为快速、精准、灵敏度高。本研究发现有可能为开发临床老年人肺炎患者的检测方法提供新的思路。

1 对象和方法

1.1 一般资料 随机选取2018年7月-2019年12月上海普陀区利群医院院就诊的38 例未经治的老年肺炎患者。患者纳入标准：年龄≥65 岁，诊断为细菌性肺炎的患者，男女性别不限。患者排除标准：痰质量不合格者和非感染原因如肺栓塞等所致的下呼吸道胸片的改变。细菌性肺炎感染诊断标准参照《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016年版）》[1]。

1.2 检测方法

1.2.1 痰液样本的采集 在患者用药前，使用纤维支气管镜置入患者支气管中吸取其中的分泌物。将收集到的患者的吸痰分成2 份分别置于无菌容器内。其中一份于2 h 内涂片行革兰染色，显微镜下计数鳞状上皮细胞和白细胞数量及其比值，痰质量检测合格后观察菌体形态特征，进行初步鉴定，照相记录。另外一份密封后于-80℃保存，后续送合作公司进行测序并分析。

1.2.2 MiSeq 测序 将-80℃低温保存的38 例份纤维支气管镜吸痰样本统一送公司进行测序。基因组DNA抽提完成后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提质量、PCR 扩增、荧光定量、Miseq 文库构建及测序，最后进行生物信息学分析。

1.2.3 生物信息学分析 经Miseq测序得到的PE reads，首先根据overlap 关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU 聚类分析和物种分类学分析。基于OTU 聚类分析结果，可以对OTU进行多种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在多个分类水平上进行群落结构的统计分析。

2 结果

2.1 OTU， 多样性及稀释曲线分析 对高通量测序所得序列进行聚类，为了得到每个OTU 对应的物种分类信息，采用RDP classifier 贝叶斯算法对97%相似水平的OTU 代表序列进行分类学分析。本实验中，16 s 细菌的比对数据库为Silva，38 个样本的总有效测序数目为4385 637 条，总有效碱基数目为1 839 833 969 bp，每条序列的平均长度为422 bp。总获得15 805 个OTU、3 690 种细菌。样本稀释曲线最终趋于平缓，且测序深度均值为0.99，说明此次测序数量大，测序深度广，可以较全面地分析呼吸道菌群信息。 多样性可以反应微生物群落的丰富度（Chao 指数）、均匀度（Simpson 指数）、多样性（Shannon 指数）、和覆盖度（Coverage 指数）。本实验Chao 指数标准差较大，Simpsoneven 指数和Shannon 指数的标准差较小，标本的菌群丰富度比较大，样本之间存在个体差异。

2.2 群落组成分析 老年下呼吸道感染人群中含有丰富的细菌种类。本项研究对38 例老年肺炎患者，平均年龄（72.5±7.3 岁）的支气管镜吸痰样本进行测序，共获得50 个门和1 562 个属的细菌。在门分类水平上，38 个样本中丰度从高到低依次为变形杆菌门（Proteobacteria），厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、髌骨细菌门（Patescibact eria）、蓝藻门（Cyanobacteria）和梭杆菌门(Fusobacteria)等；在属水平上，丰度从高到低依次为假单胞菌属（Pseudomonas）、链球菌属（Streptococcus）、普雷沃菌属（Prevotella）、韦荣氏球菌属（Veillonella）、霉浆菌属（Mycoplasma）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、节杆菌属（Arthrobacter）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和棒杆菌属（Corynebacterium）等。本研究结果表明：下呼吸道患者可能都具有丰富的细菌种类，并且以变形杆菌门的一系列未知分类单元的菌属占据优势。

2.3 痰培养分析 将另外38 个配对的痰标本进行涂片镜检，按照标准程序[2]分别接种到血平板、巧克力平板和麦康凯平板上，置35℃、5% CO2培养箱内孵育18～24 h 后，观察菌落形态；进一步将培养阳性的样本在梅里埃Vitek 2 Compact 全自动细菌分析仪进行细菌鉴定及药敏实验。本实验的38 个样本，平均每低倍视野鳞状上皮细胞数<10 个，平均每低倍视野白细胞数>25 个，表明均为合格痰标本。其中有23 株分离出咽部正常菌群，阳性率为39.5%。具体革兰染色和痰培养结果见表1。

2.4 痰培养与16s rDNA 高通量测序结果 比较分析比较传统痰培养结果和16s rDNA 高通量测序结果，如表1，如果高通量测序所占丰度最大的菌种与痰培养结果相同，本研究视两者具有一致性；由于与本次测序尚未考虑真菌、病毒等致病微生物，如果高通量测序所占丰度最大或较大的菌种为非致病菌，本研究视高通量测序结果与传统培养结果“分离出咽部正常菌群”和“曲霉菌某种属生长”具有一致性。由此，高通量测序结果与传统痰培养结果的一致性为50%。

表1 样本的革兰染色、痰培养和16srDNA 测序结果

3 讨论

肺部感染在各类感染疾病中的比例较高，有研究显示医院下呼吸道感染患者占26.75%，尤其以老年患者更容易发生呼吸道感染[3]。临床上常根据患者的临床症状、影像学检查（胸片或CT）和实验室指标进行诊断；采用经验性抗生素治疗，同时送检痰培养查找病原体，再依据痰培养病原体检查结果及体外药敏结果调整使用有效抗生素。目前，痰标本革兰染色涂片镜检仍然是呼吸道感染性疾病诊断的最经济、有效的方式，可以在半小时内出结果。合格痰标本的涂片结果与培养结果的符合率为72.78%[4]，痰涂片镜检质量直接反应痰培养检出致病菌的可能性[5]。痰液中培养出的病原菌种类及药敏试验结果对疾病的诊断和指导用药有着重要的意义[6]。但是，痰涂片和痰培养这两种方法仅能检测部分可染色、可体外培养的优势细菌，对痕量的、难以染色和培养的微生物却束手无策，且检测灵敏度较低，呼吸道感染患者痰及咽部菌群的真实种类和占比未有明确参照[7]。这个特点反映在临床工作中就是：即使当患者有明显的感染症状和体征时，痰培养的结果却常为阴性。如本次研究中，标本“PXL-XT”和“WJ-XT”高通量测序在种水平上所占丰度最大的为铜绿假单胞菌，但是传统培养并没有检出致病菌。因而，许多临床医师认为，痰培养结果对临床诊治的参考价值不大，一般还是经验性的选用抗菌药物。尽管现已有大量人体定植菌种可经培养技术得到，但据估计超过70%的人体表菌种尚未获得成功培养[8]。本项研究对38 例临床诊断为肺炎的患者进行传统培养，其中有15 例培养为阳性，阳性率与之前报道的较一致[9]。这表明传统培养法的检出阳性率较低；并且与高通量测序技术相比，它不能分析微生物群落整体。如表1，韦荣氏球菌属是厌氧性微小球菌，需厌氧培养；结核分支杆菌专性需氧，常用罗氏培养基培养2～4 周可见菌落生长；霉浆菌又称支原体，无细胞壁，人工培养营养要求较高。所以这些标本的两种培养结果具有一致性。但是奴卡菌繁殖速度慢，一般样本5～7 d 可见菌落，样本“YMZ-XT”传统培养并没有检出，属于漏检。综上，38 个样本结果一致性仅为68.4%，传统培养与高通量测序结果相差较大，鉴于此，传统培养技术可能不再是临床检测病原微生物的金标准方法[10]。

微生物多样性测序，是利用新一代高通量测序技术（NGS）对样品中微生物的16S rDNA（或18S rDNA、Internal Transcribed Spacer、功能基因等）高变区序列进行大规模、高通量测序，分析特定样品中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能。借助不同样品中或不同环境下微生物群落的构成差异分析，本研究不仅可以揭示微生物群落的多样性和结构组成，还可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关联，寻找标志性菌群或特定功能的基因，为疾病的诊疗和微生物资源的开发提供基础。本研究NGS 测序得到15 805 个OTU，3 690 个菌种，50 个菌门，测序快速，结果精准，灵敏度高，检出率高，检出范围广，检测菌种大大增多，信息量更加丰富。但是该方法检测费用相对较高，一般实验室尚未被普及，尚不能完全取代传统的痰涂片和痰培养技术。本研究38 个病例中有5 例治疗无效死亡，其中病例“XXD-XT”传统培养结果与高通量测序结果完全不一致，原因有待挖掘。抛开复杂的临床因素，单从技术层面，本研究认为痰培养技术应该被新技术取代。

本研究是在纤维支气管镜下直接获取痰标本。纤维支气管镜是指将内窥镜导入气管及支气管内，可以直接到达病灶位置，具有直视下逐级吸尽气道内的分泌物，冲洗痰痂，有效提高血氧饱和度，改善组织缺氧[11]，损伤小等优点，作为预防肺部感染及痰液药敏试验不可或缺的手段[12]。这里需要说明的是，本研究选取上海本地西北部具有代表性的老年肺炎患者的吸痰进行了高通量测序，分析的样本总量较少，尚未考虑更加复杂细致的临床情形，例如：患者的不同性别、是否具有吸烟史等等。下一步将增加样本量，同时与未发生下呼吸道感染的人群作比较，进一步探寻老年下呼吸道菌谱特征，深入探讨这些菌种分布和构成情况与下呼吸道感染发生发展的关联等。另外，本研究中尚未考察肺炎患者的真菌和病毒等致病微生物。弄清这些病原体在疾病状态下的种类、分布和组成结构，甚至与疾病发生发展的关联、在疾病诊治中的价值等，将是十分有意义的。这也将是未来研究的努力方向。

综上，本研究通过比较痰涂片和培养与高通量测序的检测方法，展示了这两种方法的检测特点，说明了高通量测序法的优越性，指出了老年患者肺炎病例检测方法的发展趋势,有可能为将来进一步开发检测老年肺炎的新方法提供思路；同时，发现老年肺炎患者的纤维支气管镜吸痰样本中存在丰富的细菌种类，从而加深了人们对疾病状态下呼吸道菌群的认识。