生物基高分子材料尼龙5单体5-氨基戊酸生物合成研究进展

罗 洲，崔华伟，涂文应，曹瑞琪，李 强，苟兴华，程 杰

(成都大学/农业农村部杂粮加工重点实验室，四川，成都，610106)

1 5-氨基戊酸概述

5-氨基戊酸(5AVA)，英文名称为5-Aminovaleric acid，分子式为C5H11NO2，分子量为117.15。5AVA溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚和苯。5AVA有1个氨基和1个羧基。其化学结构如图1所示。5AVA是一种生产尼龙5和尼龙6,5的潜在原料，也能用于合成戊二酸、δ-戊内酰胺、1,5戊二醇和5-羟基戊酸等C5平台化学品。目前工业上制备5AVA主要使用化学法。一般采用戊内酰胺或戊内酰胺聚合物水解后精制而得。这些方法与生物法相比反应条件苛刻，能耗大，设备腐蚀大，效率低，分离复杂。因此开发生物基来源的5AVA生物合成路线具有重要的现实意义。5AVA可用于合成新型人造纤维尼龙5等重要工程塑料，广泛应用于化工、轻纺等工业。2016年，全球聚酰胺的市场约为240亿美元，预计到2022年，市场需求将超过300亿美元，平均年增长率将超过5.5%。近年来随着合成生物学的快速发展，氨基酸产业在成本与产量上均取得了巨大突破。微生物发酵生产天然氨基酸的成本持续降低，全球氨基酸产量预计到2022年将突破1100万t。我国作为氨基酸生产和消费大国，大宗型氨基酸产品已处于供过于求的状态。随着L-赖氨酸合成工艺的成熟和生产成本的降低，其产能严重过剩，导致市场售价大幅降低。目前赖氨酸盐酸盐的市场价格约为1700美元/t，而5AVA约为37万美元/t，具有显著的经济效益。因此，发展使用生物基L-赖氨酸作为初始原料生产高附加值产品的新型生物技术，具有重要的经济意义和社会价值。

图1 5AVA的化学结构

2 微生物中5-氨基戊酸的生物合成路径

越来越多的环境污染、气候变暖和能源短缺等问题正在促进可持续绿色的生物制造发展。利用微生物生产5AVA，可以减少对环境的污染，是符合国家和民族走可持续发展之路的新型制造方式。由于5AVA及其衍生物具有广泛的应用前景，其合成已引起众多国内外研究者的兴趣，并开发出许多新的合成方法和技术。目前，5AVA的生物合成主要有4种途径(图2～图5)。其中，5-氨基戊酰胺介导合成5-氨基戊酸途径是最重要的途径，在恶臭假单胞菌中，L-赖氨酸通过两步酶催化反应转化为5AVA。第二条途径是戊二胺介导合成5AVA途径，以L-赖氨酸为底物，通过三步酶催化反应转化为5AVA。第三条途径是2-酮-6-氨基己酸介导的赖氨酸α-氧化酶合成5-氨基戊酸途径，以L-赖氨酸为底物，经过一步酶催化转化为中间体2-酮-6-氨基己酸，中间体在过氧化氢的作用下，自动脱羧氧化为5AVA。最后一条途径是2-酮-6-氨基己酸介导的多基因合成5-氨基戊酸途径，这是一条非天然合成途径。

2.1 5-氨基戊酰胺介导合成5-氨基戊酸途径

5AVA的天然合成途径是在恶臭假单胞菌中发现的，其合成途径见图2。首先，L-赖氨酸被L-赖氨酸2-单加氧酶(DavB)氧化脱羧为5-氨基戊酰胺。然后，5-氨基戊酰胺被δ-氨基戊酰胺酶(DavA)水解为5AVA。Liu等[1]将DavB和DavA进行分离纯化，利用生物酶法生产了20.8 g/L 5AVA，得率为0.69 g/g 赖氨酸。Wang等[2]利用全细胞催化技术，优化诱导时间、反应温度、反应时间和金属离子等，最终获得了240.7 g/L 5AVA，这是目前世界上报道的最高产量。Li等[3]过量表达赖氨酸转运蛋白LysP和4-氨基丁酸转运蛋白PP2911，进一步强化了5AVA的转运。Joo等[4]利用芒草水解液，成功制备了12.51 g/L 5AVA。

图2 5-氨基戊酸生物合成途径一

2.2 戊二胺介导合成5-氨基戊酸途径

Rohles等[5]建立了生产C5平台化学品5AVA 与戊二胺的耦合生产工艺，合成途径见图3，最优菌株能生产28g/L5AVA，最大生产率为0.9g/L/h。Jorge等[6]建立了一种戊二胺介导的5AVA合成途径，以戊二胺为中间体，赖氨酸脱羧酶(LdcC)、戊二胺转氨酶(PatA)和γ-氨基丁醛脱氢酶(PatD)三步法合成5AVA的生物合成途径，以葡萄糖胺、木糖和阿拉伯糖为替代碳源，生产了5.1g/L5AVA。

图3 5-氨基戊酸生物合成途径二

2.3 2-酮-6-氨基己酸介导单基因合成5-氨基戊酸途径

Pukin等[7]利用来源于绿色木霉的L-赖氨酸α-氧化酶(LysOx)将L-赖氨酸的α-氨基氧化成羰基，同时产生NH3和 H2O2，生成的中间体2-酮-6氨基己酸在不添加过氧化氢酶的情况下自动氧化脱羧形成5AVA，利用固定化酶LysOx在37℃条件下反应5d后成功制备了13.4g/L5AVA。Cheng等[8]将日本鲭来源的L-赖氨酸α-氧化酶(RaiP)在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达，敲除赖氨酸降解基因cadA以减少底物消耗，建立L-赖氨酸α-氧化酶单基因表达的代谢工程菌株。添加4%乙醇和10mM H2O2能显著提高5AVA的产量，最后在5-L发酵罐中生产了29.12g/L 5AVA，得率为0.44g/g赖氨酸。马金莲等[9]发现L-氨基酸氧化酶可以催化L-氨基酸的氨基生成相应酮酸，并且成功将来源于红球菌的氨基酸氧化酶在大肠杆菌中表达，并首次用于生物催化合成5AVA。结果表明催化合成5AVA时，最适底物L-赖氨酸浓度为17mmol/L，最适pH为7.0，最适温度为37℃，最适时间为24h，添加0.5% H2O2，最终5AVA产量达到16.71mmol/L。此研究成功实现了L-氨基酸氧化酶合成5AVA。

图4 5-氨基戊酸生物合成途径三

2.4 2-酮-6-氨基己酸介导多基因合成5-氨基戊酸途径

Cheng等[10]首次建立了2-酮-6-氨基己酸介导的5AVA合成途径。过量表达日本鲭来源的L-赖氨酸α-氧化酶(RaiP)、乳酸乳球菌来源的α-酮酸脱羧酶(KivD)和大肠杆菌来源的乙醛脱氢酶(PadA)，在大肠杆菌中实现L-赖氨酸到5AVA的生物合成。通过过量表达过氧化氢酶 KatE来分解RaiP产生的H2O2。利用同源性建模、分子对接和分子动力学模拟等方法识别突变位点，提出了一种可能的酶改造机制：突变体催化通道的扩大，更多氢键的形成，可能更有利于底物舒展。使用了四种策略来增加5AVA的生产。首先，赖氨酸脱羧酶基因cadA被敲除。第二，L-赖氨酸盐酸盐被用作底物。第三，H2O2可以抑制细胞生长，从而影响目标生产。因此通过过氧化氢酶KatE的表达，H2O2被分解，含量显著降低。此外，赖氨酸转运蛋白LysP 被过量表达，加强底物赖氨酸的转运。最后通过分批补料生物转化得到52.24g/L5AVA。

图5 5-氨基戊酸生物合成途径四

3 提高生物合成5-氨基戊酸产量的策略

培养基成分和培养条件对5AVA的生物合成有显著影响。为提高5AVA生物合成的经济性，研究人员对菌种选育、培养基成分优化、发酵条件优化和蛋白表达优化等策略进行了广泛的研究。虽然恶臭假单胞菌具有天然的5AVA 合成途径，但发酵过程通常很长，这增加了设备成本，进一步限制了工业化的可扩展性。因此，除了恶臭假单胞菌以外，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌合成5AVA也取得了重大突破。在工业发酵过程中，发酵培养基的成分对于代谢产物的产量和得率至关重要。

4 结语和展望

由于化学合成工艺的缺陷，生物合成5AVA受到越来越多的关注。虽然在机理认识和提高5AVA产量和得率方面取得了很大突破，但在经济上仍不具备工业化的可行性。为了将实验室研究成果转化为工业过程，底盘菌种开发和生物过程优化之间的深度集成综合开发是必要的。

综上，生物合成5AVA的方法主要有生物酶法、发酵法和全细胞催化法，每种方法各有优缺点。目前有4种5AVA生物合成途径。产量较高的是途径一：5-氨基戊酰胺介导合成5-氨基戊酸途径和途径四：2-酮-6-氨基己酸介导的多基因合成5-氨基戊酸途径，具有产业化前景。生物酶法需要进一步优化生物合成途径，控制合成的关键步骤，定向进化合成关键酶，从而获得高纯度的5AVA；发酵法需要进一步改进发酵步骤，从而提高合成5AVA的效率；全细胞催化法需要进一步提高催化效率，提高细胞密度。目前这些方法都处在实验室小试阶段，还未进行中试和产业化，还有待进一步研究改进。5AVA是合成尼龙5和尼龙5,6的重要前体物质，如今工业生产5AVA污染比较大，并且生产效率不高，所以降低5AVA生产成本是可持续发展的重要研究方向，并且拥有巨大的发展前景。随着生物科学技术的发展，生物法合成5AVA的研究也将不断改进，从而降低生产成本，提高产量。

表1 5-氨基戊酸的生物合成