过表达IrrE基因提高油菜的抗盐胁迫能力

周文波等

摘要：以过表达IrrE基因油菜T3代植株和非转基因油菜植株为试验材料，研究不同浓度NaCl胁迫下过表达IrrE对油菜植株抗盐胁迫能力的影响，检测不同浓度NaCl胁迫下非转基因和过表达IrrE基因油菜植株叶片中的抗氧化酶活性如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）的活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、脯氨酸、可溶性糖含量和相对电导率（REC）。结果显示，随着NaCl浓度的增加，非转基因和过表达IrrE基因油菜植株各自的抗氧化酶活性均呈现先增强后减弱的趋势，而MDA含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量和相对电导率都随着NaCl浓度的增加而逐渐增加；但与非转基因相比，在高浓度NaCl胁迫下过表达IrrE基因油菜植株具有较高的抗氧化酶活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量以及较低的MDA含量和相对电导率，表明在高盐胁迫下过表达IrrE能够显著地提高转基因油菜植株的抗盐胁迫能力。

关键词：IrrE基因；油菜；盐胁迫；氧化酶

中图分类号： Q945.78文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0104-04

收稿日期：2014-08-31

基金项目：国家重点基础研究发展计划（编号：2013CB733903）；国家“863”计划（编号：2012AA063503）；国家转基因专项（编号：2014ZX0801201B）；公益性行业（农业）科研专项（编号：201103007）；西南科技大学博士研究基金（编号：11zx7104）；四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心开放基金（编号：13zxsk04）。

作者简介：周文波（1987—），男，四川自贡人，硕士研究生，从事植物遗传转化与抗逆分析研究。E-mail：zhouwenboxkd@sina.com。

通信作者：王劲，教授，从事植物遗传方向的研究。E-mail：wjdsz@vip.sina.com。近年来，由于人们在农业生产过程中的不科学灌溉、滥用化肥、滥伐森林导致的植被破坏以及工业活动产生的温室气体等因素，使土壤盐碱化问题日益严重，土壤盐碱化已成为制约农业生产发展的重要因子之一[1-2]。相关数据显示，全球盐碱土总面积约为10亿hm2，约占陆地面积的10%；世界上许多国家和地区的土壤均存在盐碱化的风险，中国受盐碱化影响的土地面积占可利用土地总面积的4.88%[3]。因此，对盐碱地的改造治理、合理开发、高效利用势在必行。随着现代分子生物技术的飞速发展，利用分子育种技术尤其是转基因技术培育抗盐胁迫作物新品种已成为当前抗逆研究的热门领域，也成为高效利用开发盐碱土的重要手段之一。因此，了解植物抗盐胁迫的分子调控机理与抗盐胁迫基因的充分挖掘和研究对培育抗盐胁迫作物新品种具有重要意义。

土壤含盐量过高严重影响植物的生长和发育，过量盐离子主要通过引发渗透胁迫、离子毒害和氧化胁迫对植物造成伤害，植物则通过调节气孔开度、合成渗透调节物质、区隔过量离子以及清除活性氧物质等方式来减轻胁迫损伤[4]。IrrE基因定位于耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）的基因组1号染色体上，编号DR_0167，全长987 bp，其在耐辐射异常球菌对电离辐射引起的DNA损伤修复过程中具有重要作用。IrrE基因作为一种辐射应答的调节因子，可以调节异常球菌 R1中recA和pprA基因的表达，他们分别编码重组酶A和辐射诱导蛋白[5]。Gao等研究发现，将IrrE基因在大肠杆菌中异源表达能够提高菌株的辐射抗性以及氧自由基的清除能力[6]。Pan等对转IrrE基因菌株及对照菌株进行了一系列胁迫试验，结果显示IrrE提高了大肠杆菌的抗盐胁迫、抗氧化胁迫以及抗高温胁迫的能力；为研究IrrE在植物中的抗逆效果，Pan等又将IrrE基因转入油菜中，结果显示转基因油菜植株能够在350 mmo/L NaCl处理下6周后正常开花结子，而对照非转基因油菜植株在相同条件下处理2周后死亡[7]。

但目前对IrrE基因在植物中是如何提高植株抵抗逆境胁迫能力的分子机理还知之甚少，相关研究报道也很少。先前的研究以转IrrE基因油菜T0代植株为试验材料，其后代植株抵抗盐胁迫的能力如何还不清楚。因此，本研究以转IrrE基因油菜T3代植株为试验材料，以非转基因油菜植株为对照，探讨不同盐浓度胁迫下IrrE基因过表达对油菜植株相关生理生化的影响，为充分了解过表达IrrE基因在植物抵抗盐胁迫过程中的作用和在农业生产实践中应用IrrE基因培育抗盐作物新品种提供相应的理论依据。

1材料与方法

1.1材料培养与盐胁迫处理

非转基因甘蓝型油菜（Brassica napus）种子84100-18（玻里马细胞质雄性不育恢复系）由四川大学遗传学实验室提供，过表达IrrE转基因T3代油菜种子由西南科技大学生命科学与工程学院极端环境生物资源与利用实验室以84100-18为受体材料遗传转化而得。将非转基因油菜种子和转基因油菜种子灭菌后分别接种在MS和含50 mg/L卡那霉素的MS培养基上，催芽生根后分别播于塑料盆中，每盆2株幼苗，以蛭石 ∶营养土=1 ∶3为基质，MS营养液培养，置于温室[光周期，16 h光照、8 h黑暗；光照强度500 μmol/（m2·s）；温度（25±4） ℃；相对湿度80%]下培养。

待油菜幼苗长出5～6张真叶时进行盐胁迫处理，每个处理3盆（重复3次）。不同浓度NaCl处理分为7组：在1/2MS营养液中分别加入0、100、150、200、250、300、350 mmol/L NaCl，溶液浇灌量约为200 mL，浸透培养基质，盆底垫塑料托盘，以便及时将流出的盐溶液倒回盆内，防止盐分流失。处理24 h后，采样（选取植株由上到下第3张叶片，去除叶脉后，剪碎混匀），用于PCR和相应生理生化指标检测。

1.2T3代转基因油菜植株的PCR检测

用CTAB法提取转基因油菜叶片的总DNA，以此为模板，以PBI121-IrrE载体的质粒为阳性对照，以非转基因植株为阴性对照进行PCR检测。PCR检测上游引物IrrE-up：5′- ATCCCTGTTAAGCTCCCATTCG-3′以及下游引物IrrE-down：5′-GACGGGTTCGGGCATCAAA-3′。PCR反应体系为20 μL：1 μL模板DNA，2 μL 10×Taq buffer，2 μL dNTPs，引物各1 μL，0.2 μL Taq聚合酶，加灭菌水补齐至终体积。反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3生理生化指标的检测

1.3.1粗酶液的提取称取2 g植物叶片，置于预冷的研钵中，加入少量的石英砂和预冷的4 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液（pH值7.0，含1%PVP、0.1%巯基乙醇）于冰浴上研磨成匀浆，全部转入5 mL干净的离心管中，于4 ℃、13 000 g离心 10 min，将上清液分装至干净的1.5 mL离心管中，保存于 -20 ℃ 备用。

1.3.2抗氧化酶活性的检测过氧化物酶（peroxidase，POD）活性的测定采用愈创木酚法[8]，以1 min D470 nm变化001为1个酶活性单位[U/（g·min）]；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的检测采用氮蓝四唑（NBT）法[9]，以抑制NBT光还原50%作为1个酶活性单位（U/g）；过氧化氢酶（catalase，CAT）活性的检测采用H2O2法[10-11]，以25 ℃下100 s内在反应体系中分解50% H2O2的酶量作为1个酶活性单位 （U/g）。

1.3.3其他生理生化指标的检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[12]；细胞膜透性的测定用相对电导率（REC）法[13]；脯氨酸与可溶性糖含量的测定分别用酸性茚三酮比色法[14]和蒽酮比色法[15]。

1.4数据处理

采用SAS 8.0 和Excel对数据进行分析处理及作图。

2结果与分析

2.1IrrE基因的PCR检测

对T3代转基因油菜植株进行PCR检测，结果（图1）表明，转基因植株的基因组DNA均扩增出与阳性质粒（对照）同样大小的目的片段（396 bp），而非转基因植株的基因组DNA未扩增出条带。

2.2过表达IrrE基因提高油菜植株叶片抗氧化酶活性

随着NaCl浓度的增加，转基因油菜植株与非转基因油菜植株的抗氧酶活性均呈现先增加后降低的趋势，但前者的抗氧酶活性高于后者的活性（图2）。在0、100、150 mmol/L NaCl胁迫下，转基因油菜植株与非转基因油菜植株POD活性和SOD活性差异不显著；但在200、250、300、350 mmol/L NaCl胁迫下，转基因油菜植株的POD活性和SOD活性均显著高于非转基因油菜植株，其中转基因油菜植株的POD活性比非转基因油菜植株分别高17.6%、17.9%、56.0%、572%，转基因油菜植株的SOD活性比非转基因油菜植株分别高出17.3%、46.0%、57.2%、54.3%。在0～150 mmol/L NaCl胁迫下，转基因油菜植株的CAT活性与非转基因油菜植株差异不显著；但在200、250、300、350 mmol/L NaCl胁迫下，转基因油菜植株的CAT活性显著高于非转基因油菜植株，分别高12.4%、22.6%、63.3%、104.0%。

2.3过表达IrrE基因提高油菜植株叶片在高盐胁迫下细胞的渗透调节能力

在0～300 mmol/L NaCl胁迫下，尽管转基因油菜植株可溶性糖含量与非转基因油菜差异不显著，但转基因油菜植株的可溶性糖含量在不同浓度下都高于非转基因油菜植株；在350 mmol/L NaCl胁迫下，转基因油菜植株的可溶性糖含量显著高于非转基因油菜植株，前者比后者高14.8%（图3-A）。转基因油菜植株的脯氨酸含量在250、300、350 mmol/L NaCl胁迫下极显著地高于非转基因油菜植株，分别高19.6%、532%、21.9%；在0～200 mmol/L NaCl胁迫下，转基因油菜植株与非转基因油菜的脯氨酸含量差异不显著，但转基因油菜植株的脯氨酸含量仍然高于非转基因油菜植株（图3-B）。

2.4过表达IrrE基因提高油菜植株叶片在盐胁迫下细胞膜的结构稳定性

随着盐浓度的增加，转基因油菜植株和非转基因油菜植

株的MDA含量和REC均呈现逐渐增加的趋势，但前者增加幅度小于后者（图4）；在0、100 mmol/L NaCl胁迫下，二者的MDA含量和REC差异不显著；在150、200、250、300、350 mmol/L NaCl胁迫下，转基因油菜植株的MDA含量和REC显著低于非转基因油菜植株，转基因油菜植株的MDA含量分别低于非转基因油菜植株20.0%、38.3%、23.8%、22.5%、20.8%（图4-A），而转基因油菜植株的REC分别低于非转基因油菜植株13.2%、20.2%、22.2%、31.1%、252%（图4-B）。

3结论与讨论

盐胁迫会使植物细胞形成渗透和离子胁迫，且细胞质会积累一些小分子的有机物如脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱等来缓解渗透胁迫[16-17]。在本研究中，在高浓度（250、300、350 mmol/L）NaCl胁迫下，转基因植株叶片的脯氨酸含量和可溶性糖含量均明显高于对照，说明过表达IrrE能够调节转基因植株叶片脯氨酸和可溶性糖量的积累，维持细胞内外的渗透平衡，减少细胞因渗透胁迫而造成的功能降低。

非生物胁迫下，植物体内形成大量的活性氧，如氢氧根负离子（OH—）、自由羟基（·OH）、过氧化氢（H2O2）等[18]。这些活性氧不及时清除就会损伤植物细胞，尤其是造成细胞质膜的过氧化；相应地，植物体内有一个活性氧清除体系，产生的活性氧能及时被植物体内抗氧化酶清除，这些抗氧化酶主要有SOD、CAT、POD、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等[19]。植物的抗氧化酶活性越高，清除活性氧的能力越强，植物抗非生物胁迫的能力就越强[20]。本研究中，在高浓度（200、250、300、350 mmol/L）NaCl胁迫下，转基因植株的抗氧化酶活性（SOD、CAT、POD）均明显强于对照，而低浓度（100、150、200 mmol/L）NaCl胁迫下，差异虽不明显，但转基因的抗氧化酶活性均高于非转基因。说明过表达IrrE能够增强转基因植株的抗氧化酶活性，增强植株清除活性氧的能力。这可能是由于IrrE基因作为一个全局调控因子，能调节油菜多种抗逆基因的高表达，如SOD、CAT基因等[7]。

在盐胁迫下，植物叶片最先受到破环的是细胞膜，大量的活性氧导致质膜过氧化产生MDA以及电解质大量外渗，进而细胞膜结构的完整性遭到破坏[21]。本研究中，高浓度（200、250、300 mmol/L）NaCl胁迫下，转基因植株MDA含量和REC均显著低于非转基因，说明过表达IrrE通过增强抗氧化酶活性来清除高浓度盐胁迫形成的活性氧，减轻质膜的损伤程度，维持膜结构的完整性。

Pan等最早报道油菜中过表达IrrE能提高转基因植株在高盐胁迫下的存活能力[7]；奉斌等也曾报道在烟草中过表达IrrE能提高转基因植株耐旱能力[22]；童仕波等发现，在拟南芥中过表达IrrE能提高转基因植株对盐胁迫的耐受性[23]。本研究进一步证明了转IrrE基因油菜的后代T3在高盐浓度胁迫下，过表达IrrE能够提高转基因油菜植株的抗盐胁迫能力。可见，IrrE在植物抵抗盐胁迫和干旱胁迫中起重要作用，这为以后利用IrrE培育抗盐作物新品种提供相应的理论依据。

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