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4种虾虎鱼类精子超微结构的研究与比较

2016-01-27王茜王小刚李鹏等

江苏农业科学 2015年11期
关键词:电子显微镜超微结构精子

王茜 王小刚 李鹏等

摘要:采用扫描电镜和透射电镜分别对云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢精子的超微结构进行了比较研究。研究结果显示:在扫描电镜下云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢精子均由头部和尾部(即鞭毛)组成。2种尖塘鳢鱼类精子头部均为圆球形,而2种沙塘鳢精子头部则为前端略方的长椭圆形;在透射电镜下这4种虾虎鱼的精子均由头部、中段(即颈部)和尾部(即鞭毛)3部分组成。头部细胞核前端无顶体,细胞核后端的植入窝均较浅,中段不明显,包括中心粒复合体和袖套。云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢的袖套中含有6~8个呈环形单层排列的线粒体,河川沙塘鳢和鸭绿沙塘鳢的袖套中含有2~3个线粒体。这4种虾虎鱼类精子尾部的鞭毛细长,轴丝均为典型的“9+2”型结构,轴丝外侧具有较发达的侧鳍。

关键词:虾虎鱼;精子;超微结构;电子显微镜

中图分类号: S961.2文献标志码: A文章编号:1002-1302(2015)11-0320-03

收稿日期:2014-12-16

基金项目:国家星火计划(编号:2013GA690166);江苏省科技支撑计划(编号:BE2013441);江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目(编号:2012-NY-032);海南大学科研基金(编号:kyqd1525)。

作者简介:王茜(1982—),女,博士,助理研究员,主要从事鱼类遗传育种研究。E-mail:wangqian170@163.com。

通信作者:尹绍,博士,教授,主要从事鱼类遗传育种研究。E-mail:yinshaowu@163.com。云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmoratus,俗称泰国笋壳鱼)和线纹尖塘鳢(Oxyeleotris lineolatus,俗称澳洲笋壳鱼),均隶属于鲈形目(Perciformes)虾虎鱼亚目(Gobioidei)塘鳢科(Eleotridae)尖塘鳢属(Oxyeleotris),分布于东南亚的江河、湖泊及水库中,是塘鳢科乃至虾虎鱼亚目中体型大且生长快的淡水经济鱼类。河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)和鸭绿沙塘鳢(Odontobutis yaluensis),均隶属于鲈形目(Perciformes)虾虎鱼亚目(Gobioidei)沙塘鳢科(Odontobutidae)沙塘鳢属(Odontobutis)。河川沙塘鳢是一种小型经济鱼类,主要分布于我国长江中下游及沿江各支流、钱塘江水系、闽江水系。而鸭绿沙塘鳢是中小型溪流经济鱼类,主要分布于鸭绿江中下游、辽河东部山区支流太子河、大洋河和辽东半岛碧流河[1]。因这4种虾虎鱼均具有肉质细嫩鲜美、营养价值高、无肌间刺等诸多优点,深受广大消费者喜爱。到目前为止,仅见胡亚丽等对云斑尖塘鳢精子的超微结构[2]的报道。本研究采用扫描和透射电镜对这4种鱼类精子的超微结构进行观察比较,为进一步研究虾虎鱼类受精生物学、生殖生理特性等提供基础依据。

1材料与方法

1.1试验材料

(1)云斑尖塘鳢雄鱼:2011年4月15日购自海南断山渔业有限公司三亚笋壳鱼繁育基地,空运至南京。水温24~27 ℃暂养10~15 d后,选择体质健壮的雄鱼进行人工催产,剂量为每1 000 g体质量注射LHRH-A2(促黄体生成激素释放激素

8~15 μg[2],或者每1 000 g 体质量注射HCG(人绒毛膜促性腺激素)350~400 IU。(2)线纹尖塘鳢雄鱼:2013年4月2日购自海南断山渔业有限公司三亚笋壳鱼繁育基地,空运至南京。水温24~27 ℃暂养7~10 d后,选择体质健壮的雄鱼进行人工催产,剂量为每尾注射PG(脑垂体) 1 mg+HCG 350~400 IU。(3)河川塘鳢雄鱼:2012年3月15日购自江苏省宝应县射阳湖镇平江村宋泾河流域。水温22~25 ℃暂养7~10 d后进行人工催产,剂量为每1 000 g体质量注射LHRH-A2 5~8 μg+ HCG 200~300 IU。(4)鸭绿沙塘鳢雄鱼:2012年4月12日购自辽宁省抚顺市新宾县太子河流域,在江苏省溧阳市金泉特种水产繁育场暂养20 d左右,于5月2日运回实验室。水温20~23 ℃暂养5~7 d后进行人工催产,剂量为每1 000 g体质量注射LHRH-A2 2~4 μg+ HCG 250~350 IU。

达到效应时间后,用干燥的毛巾将雄鱼生殖孔处的水分擦净,轻压鱼体腹部挤出精液,弃去最初挤出的精液,随后用干净的胶头滴管吸取乳白色精液备用。

1.2方法

1.2.1扫描电镜样品制备扫描电镜样品制备,参照胡亚丽等的制备方法[2]。

1.2.2透射电镜样品制备先将精液放在预冷的2. 5%戊二醛中前固定,将精子悬液以1 000~2 000 r/min 离心1~2 min,弃去上清液,PBS 缓冲液漂洗5 min,重复3次。然后沉淀包埋于2%琼脂中,包埋块再放置于2. 5%戊二醛中 4 ℃ 过夜,PBS缓冲液漂洗10 min,重复3次。次日再进行后固定,即转入1%锇酸后在4 ℃固定2 h。PBS缓冲液冲洗3次,每次10 min,丙酮梯度系列脱水,每级脱水15 min。采用Epon-812环氧树脂渗透包埋,在35、45、60 ℃聚合炉中固化,每级24 h。用ULTRACUT E半薄切片机切片,厚度2 μm,甲苯胺蓝染色,光镜定位,再用LEICA ULTRACUT R超薄切片机切片,厚度约80 nm,经醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色后,用日立H-7650型透射电子显微镜进行观察和显微摄影。

2结果与分析

2.1扫描电子显微镜观察

2.1.1云斑尖塘鳢精子由头部和尾部(鞭毛)2部分构成。头部呈圆球形,外表面凹凸不平呈波浪状,其后紧接着由6~7个线粒体在轴丝周围围成的1圈;尾部自头部后端的正中部向后延伸,纤细且长(图1-1)。头部直径为1.98~2.12 μm,尾部鞭毛长23.22~32.92 μm[2]。

2.1.2线纹尖塘鳢精子由头部和尾部构成。头部近似圆球形,表面不平且波纹稍深,明显可见头部后紧接着由7~8个线粒体在轴丝周围围成的1圈;细长的尾部鞭毛自头部后端的正中向后延伸(图1-2、图1-3)。头部直径为1.68~2.08 μm,尾部鞭毛长16.01~25.32 μm。

2.1.3河川沙塘鳢精子由头部和尾部构成。头部呈前端略方的长椭圆形,头部外表面凹凸不平呈不规则的浅网格状,其后紧接着由2~3个线粒体围成的1圈;鞭毛自头部后端的正中向后延伸(图1-4)。头部长径为2.64~3.58 μm,短径为1.13~1.50 μm,尾部鞭毛长27.45~36.42 μm。

2.1.4鸭绿沙塘鳢精子由头部和尾部构成。头部呈前端略方的长椭圆形,中间略凹,头部外表面纹路较浅,其后紧接着2~3个线粒体分布在鞭毛周围;鞭毛从头部后端的正中向后伸出(图1-5)。头部长径为2.83~3.24 μm,短径为1.38~1.60 μm,尾部鞭毛长19.57~27.98 μm。

2.2透射电子显微镜观察

2.2.1云斑尖塘鳢精子由头部、中段(颈部)和尾部(鞭毛)3部分组成。(1)头部细胞核纵切面呈扁卵圆形,细胞核的后端正中有很浅的植入窝。核膜与质膜间存在着较小的间隙,细胞质膜表面呈凹凸不平状。核内的染色质呈颗粒状或短棒状。染色质中可见到数量很少的空隙(即核泡)。(2)中段(颈部)较短且不太明显,其主要结构是中心粒复合体(即近端中心粒和远端中心粒)及袖套。近端中心粒长轴与远端中心粒垂直,呈“T”字形。袖套中含有线粒体6~7个,呈单层环状排列。线粒体内可见清晰的线粒体嵴。在袖套的纵切面可见2~4个圆形线粒体(图2-1),而横切面可见6~7个线粒体(图2-2)。(3)尾部(鞭毛)细长,从头部后端很浅的植入窝伸出。鞭毛的轴丝具有典型的“9+2”型结构(图2-3),外周是9组二联微管,中央是1组微管对。在鞭毛的横切面上可见轴丝两侧具有发达的侧鳍,侧鳍的基部有囊泡[2]。

2.2.2线纹尖塘鳢精子由头部、中段和尾部组成。(1)头部纵切面呈卵圆形,后端正中有较浅的植入窝。细胞质膜表面不平整,核膜与质膜间的间隙较小,其间分布有细胞质、囊泡、溶酶体等。核内染色质致密,呈颗粒或短棒状。(2)中段较短且不明显,主要包括中心粒复合体和袖套。袖套紧接于细胞核的后端,呈短圆筒状,两边对称,袖套中含有线粒体 7~8个,呈单层环状排列,线粒体内的线粒体嵴清晰可见。袖套的纵切面可见3~4个圆形线粒体(图2-4),而横切面可见7~8个线粒体(图2-5)。(3)尾部细长,从植入窝中伸出,鞭毛的轴丝具有典型的“9+2”型结构,其横切面可见轴丝两侧发达的侧鳍。

2.2.3河川沙塘鳢精子由头部、中段和尾部组成。(1)头部细胞核纵切面呈前端略方的长椭圆形,头部后端正中部位有1个较浅的植入窝,凹陷约为头部的1/6(图2-6)。核膜与质膜间有小间隙,核内的染色质致密呈颗粒状,染色质中可见到数量较少的空隙。(2)中段较短且不太明显,主要包含中心粒复合体和袖套。袖套中含有线粒体2~3个,环状排列在轴丝周围,线粒体内可见清晰的线粒体嵴。在精子的纵切面可见2个圆形线粒体(图2-6),在袖套的横切面可见2个线粒体(图2-7)。(3)尾部细长,从头部后端较浅的植入窝伸出。鞭毛的轴丝具有典型的“9+2”型结构,在鞭毛的横切面上可见轴丝两侧具有发达的侧鳍。

2.2.4鸭绿沙塘鳢精子由头部、中段和尾部构成。(1)头部纵切面呈长椭圆形,前端一侧略方。头部后端正中部位有1个较浅的植入窝,凹陷为头部的1/5~1/4。核膜与质膜间有小间隙,核内的染色质致密,呈颗粒状,染色质中可见到少量的空隙。(2)中段较短且不明显,包括中心粒复合体和袖套。袖套中含有线粒体2~3个,环状排列呈1圈,线粒体内可见清晰的线粒体嵴。在精子的纵切面可见2个圆形线粒体(图2-8)。③尾部细长,从头部后端伸出。鞭毛的轴丝由远端中心粒向外延伸,具有典型的“9+2”型结构,轴丝两侧具有侧鳍。

3讨论

通过对云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、河川沙塘鳢、鸭绿沙塘

鳢精子的超微结构进行比较, 发现它们有以下相同点和不同之处。相同的是,在扫描电镜下观察,精子均由头部和尾部(鞭毛)构成。在透射电镜下观察,精子均由头部、中段和尾部构成,中段较短且不太明显;精子头部的前端均没有顶体结构;尾部轴丝均具有典型的“9+2”型结构;精子鞭毛的轴丝两侧均具有发达的侧鳍。不同的是,在扫描电镜下云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢精子头部均呈圆球形,而河川沙塘鳢和鸭绿沙塘鳢精子头部呈前端略方的长椭圆形;云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢头部细胞核中染色质致密,只见到数量很少的空隙(即核泡),鸭绿沙塘鳢染色质中见到的核泡稍多些,而河川沙塘鳢中见到的核泡则相对较多;在透射电镜下,云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢的袖套中含有线粒体数量较多(为6~8个),呈单层环状排列,而河川沙塘鳢及鸭绿沙塘鳢袖套中仅含有线粒体2~3个,排列在轴丝的周围;云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢的植入窝最浅,河川沙塘鳢的植入窝较浅,凹陷约为头部的1/6,鸭绿沙塘鳢的植入窝相对较深,凹陷为头部的1/5~1/4;从精子的鞭毛长度来看,河川沙塘鳢最长(27.45~36.42 μm)、云斑尖塘鳢次之(23.22~32.92 μm),鸭绿沙塘鳢再次之(19.57~27.98 μm),线纹尖塘鳢最短(16.01~25.32 μm),但均比同为塘鳢科的中华乌塘鳢精子的鞭毛(15.5~17.5 μm)[3]要长。比较这4种虾虎鱼类精子的超微结构发现,同属中2种虾虎鱼类的精子超微结构相似,而不同属的虾虎鱼类间精子超微结构存在较大差异,这与同属的鱼类亲缘关系较近相一致。

在云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢精子的超微结构中可以看到,与大多数硬骨鱼类一样,精子头部前端均无顶体结构[4]。在透射电镜下4种虾虎鱼类精子头部呈扁卵圆形或椭圆形,这与大多数体外受精硬骨鱼类的精子头部相近,如草鱼和兴国红鲤[5],而与江黄颡鱼[6]不同,其精子头部呈马鞍形。对黄颡鱼[7]和长吻[8]的研究发现,它们均具有非常发达的植入窝,黄颡鱼的植入窝呈井状,长吻的植入窝极深,凹入深度约为精子头部长径的5/6,而4种虾虎鱼类精子头部的植入窝均较浅。在长吻[8]和褐菖鲉[9]中,其袖套中分别含有16个或30~40个线粒体,且呈多层排列,而4种虾虎鱼类精子的袖套线粒体数量较少,且呈单层排列。4种虾虎鱼精子的鞭毛轴丝均具有典型的“9+2”型双联管结构,而长薄鳅等[10]的尾部则为“9+3”式微管结构。与黄颡鱼[7]、长吻[8]、褐菖鲉[9]等相同,这4种虾虎鱼类精子的尾部轴丝两侧都有比较发达的侧鳍,而有些鱼类的精子则无侧鳍,如鲤鱼[11]、刀鲚[12]等。鞭毛是精子的运动器官,Stoss[13]认为侧鳍可能改善精子鞭毛的游泳速率,有利于提高受精率,而Afzelius[14]则认为侧鳍与精子游泳速率的提高无多大关系,侧鳍的有无是否影响精子的游泳速率,从而影响受精效率,不同学者存在不同的看法。

参考文献:

[1]伍汉霖,钟俊生. 中国动物志:硬骨鱼纲·鲈形目·虾虎鱼亚目[M]. 北京:科学出版社,2008.

[2]胡亚丽,刘洋,朱晓平,等. 云斑尖塘鳢精子的超微结构[J]. 淡水渔业,2012,42(6):73-77.

[3]何振邦,洪万树,陈仕玺,等. 中华乌塘鳢精子入卵过程的扫描电镜观察[J]. 厦门大学学报:自然科学版,2009,48(1):128-133.

[4]刘雪珠,杨万喜. 硬骨鱼类精子超微结构及其研究前景[J]. 东海海洋,2002,20(3):32-37.

[5]林光华,林琼,胡成钰,等. 草鱼、兴国红鲤和革胡子鲇精子超微结构的比较研究[J]. 南昌大学学报:理科版,1998,22(3):90-94.

[6]刘利平,王武,赵雷蕾,等. 江黄颡鱼精子的超微结构[J]. 上海水产大学学报,2004,13(3):198-202.

[7]龙永隆,林丹军. 黄颡鱼(Pseudobagrus fulvidraco)精子的超微结构[J]. 实验生物学报,1996,29(3):235-245.

[8]张耀光,罗泉笙,钟明超. 长吻精巢及精子结构的研究[J]. 水生生物学报,1993,17(3):246-251,293-294.

[9]林丹军,尤永隆.褐菖鲉精细胞晚期的变化及精子结构研究[J]. 动物学研究,1998,19(5):24-30.

[10]王志坚,殷江霞,张耀光. 长薄鳅的精巢发育和精子发生[J]. 淡水渔业,2009,39(1):3-9.

[11]尤永隆,林丹军. 鲤鱼精子超微结构的研究[J]. 动物学研究,1996,17(4):377-383.

[12]王冰,万全,李飞,等. 刀鲚精子超微结构研究[J]. 水生态学杂志,2010,3(3):57-63.

[13]Stoss J. Fish gamete preservation and spermatozoon physiology [M]//Hoar W S,Randall D J,Randall E M. Fish physiology. 8th ed. New York:Academic Press,1983:307-308.

[14]Afzelius B A. Fine structure of the garfish spermatozoon [J]. Journal of Ultrastructure Research,1978,64:309-324.崔月明,胡庭俊,秦津,等. 马尾藻多糖脂质体纳米制剂对南美白对虾抗病力的影响[J]. 江苏农业科学,2015,43(11

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