4种虾虎鱼类精子超微结构的研究与比较

王茜　王小刚　李鹏等

摘要：采用扫描电镜和透射电镜分别对云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢精子的超微结构进行了比较研究。研究结果显示：在扫描电镜下云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢精子均由头部和尾部（即鞭毛）组成。2种尖塘鳢鱼类精子头部均为圆球形，而2种沙塘鳢精子头部则为前端略方的长椭圆形；在透射电镜下这4种虾虎鱼的精子均由头部、中段（即颈部）和尾部（即鞭毛）3部分组成。头部细胞核前端无顶体，细胞核后端的植入窝均较浅，中段不明显，包括中心粒复合体和袖套。云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢的袖套中含有6～8个呈环形单层排列的线粒体，河川沙塘鳢和鸭绿沙塘鳢的袖套中含有2～3个线粒体。这4种虾虎鱼类精子尾部的鞭毛细长，轴丝均为典型的“9+2”型结构，轴丝外侧具有较发达的侧鳍。

关键词：虾虎鱼；精子；超微结构；电子显微镜

中图分类号： S961.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0320-03

收稿日期：2014-12-16

基金项目：国家星火计划（编号：2013GA690166）；江苏省科技支撑计划（编号：BE2013441）；江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目（编号：2012-NY-032）；海南大学科研基金（编号：kyqd1525）。

作者简介：王茜（1982—），女，博士，助理研究员，主要从事鱼类遗传育种研究。E-mail：wangqian170@163.com。

通信作者：尹绍，博士，教授，主要从事鱼类遗传育种研究。E-mail：yinshaowu@163.com。云斑尖塘鳢（Oxyeleotris marmoratus，俗称泰国笋壳鱼）和线纹尖塘鳢（Oxyeleotris lineolatus，俗称澳洲笋壳鱼），均隶属于鲈形目（Perciformes）虾虎鱼亚目（Gobioidei）塘鳢科（Eleotridae）尖塘鳢属（Oxyeleotris），分布于东南亚的江河、湖泊及水库中，是塘鳢科乃至虾虎鱼亚目中体型大且生长快的淡水经济鱼类。河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）和鸭绿沙塘鳢（Odontobutis yaluensis），均隶属于鲈形目（Perciformes）虾虎鱼亚目（Gobioidei）沙塘鳢科（Odontobutidae）沙塘鳢属（Odontobutis）。河川沙塘鳢是一种小型经济鱼类，主要分布于我国长江中下游及沿江各支流、钱塘江水系、闽江水系。而鸭绿沙塘鳢是中小型溪流经济鱼类，主要分布于鸭绿江中下游、辽河东部山区支流太子河、大洋河和辽东半岛碧流河[1]。因这4种虾虎鱼均具有肉质细嫩鲜美、营养价值高、无肌间刺等诸多优点，深受广大消费者喜爱。到目前为止，仅见胡亚丽等对云斑尖塘鳢精子的超微结构[2]的报道。本研究采用扫描和透射电镜对这4种鱼类精子的超微结构进行观察比较，为进一步研究虾虎鱼类受精生物学、生殖生理特性等提供基础依据。

1材料与方法

1.1试验材料

（1）云斑尖塘鳢雄鱼：2011年4月15日购自海南断山渔业有限公司三亚笋壳鱼繁育基地，空运至南京。水温24～27 ℃暂养10～15 d后，选择体质健壮的雄鱼进行人工催产，剂量为每1 000 g体质量注射LHRH-A2（促黄体生成激素释放激素

8～15 μg[2]，或者每1 000 g 体质量注射HCG（人绒毛膜促性腺激素）350～400 IU。（2）线纹尖塘鳢雄鱼：2013年4月2日购自海南断山渔业有限公司三亚笋壳鱼繁育基地，空运至南京。水温24～27 ℃暂养7～10 d后，选择体质健壮的雄鱼进行人工催产，剂量为每尾注射PG（脑垂体） 1 mg+HCG 350～400 IU。（3）河川塘鳢雄鱼：2012年3月15日购自江苏省宝应县射阳湖镇平江村宋泾河流域。水温22～25 ℃暂养7～10 d后进行人工催产，剂量为每1 000 g体质量注射LHRH-A2 5～8 μg+ HCG 200～300 IU。（4）鸭绿沙塘鳢雄鱼：2012年4月12日购自辽宁省抚顺市新宾县太子河流域，在江苏省溧阳市金泉特种水产繁育场暂养20 d左右，于5月2日运回实验室。水温20～23 ℃暂养5～7 d后进行人工催产，剂量为每1 000 g体质量注射LHRH-A2 2～4 μg+ HCG 250～350 IU。

达到效应时间后，用干燥的毛巾将雄鱼生殖孔处的水分擦净，轻压鱼体腹部挤出精液，弃去最初挤出的精液，随后用干净的胶头滴管吸取乳白色精液备用。

1.2方法

1.2.1扫描电镜样品制备扫描电镜样品制备，参照胡亚丽等的制备方法[2]。

1.2.2透射电镜样品制备先将精液放在预冷的2. 5%戊二醛中前固定，将精子悬液以1 000～2 000 r/min 离心1～2 min，弃去上清液，PBS 缓冲液漂洗5 min，重复3次。然后沉淀包埋于2%琼脂中，包埋块再放置于2. 5%戊二醛中 4 ℃ 过夜，PBS缓冲液漂洗10 min，重复3次。次日再进行后固定，即转入1%锇酸后在4 ℃固定2 h。PBS缓冲液冲洗3次，每次10 min，丙酮梯度系列脱水，每级脱水15 min。采用Epon-812环氧树脂渗透包埋，在35、45、60 ℃聚合炉中固化，每级24 h。用ULTRACUT E半薄切片机切片，厚度2 μm，甲苯胺蓝染色，光镜定位，再用LEICA ULTRACUT R超薄切片机切片，厚度约80 nm，经醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色后，用日立H-7650型透射电子显微镜进行观察和显微摄影。

2结果与分析

2.1扫描电子显微镜观察

2.1.1云斑尖塘鳢精子由头部和尾部（鞭毛）2部分构成。头部呈圆球形，外表面凹凸不平呈波浪状，其后紧接着由6～7个线粒体在轴丝周围围成的1圈；尾部自头部后端的正中部向后延伸，纤细且长（图1-1）。头部直径为1.98～2.12 μm，尾部鞭毛长23.22～32.92 μm[2]。

2.1.2线纹尖塘鳢精子由头部和尾部构成。头部近似圆球形，表面不平且波纹稍深，明显可见头部后紧接着由7～8个线粒体在轴丝周围围成的1圈；细长的尾部鞭毛自头部后端的正中向后延伸（图1-2、图1-3）。头部直径为1.68～2.08 μm，尾部鞭毛长16.01～25.32 μm。

2.1.3河川沙塘鳢精子由头部和尾部构成。头部呈前端略方的长椭圆形，头部外表面凹凸不平呈不规则的浅网格状，其后紧接着由2～3个线粒体围成的1圈；鞭毛自头部后端的正中向后延伸（图1-4）。头部长径为2.64～3.58 μm，短径为1.13～1.50 μm，尾部鞭毛长27.45～36.42 μm。

2.1.4鸭绿沙塘鳢精子由头部和尾部构成。头部呈前端略方的长椭圆形，中间略凹，头部外表面纹路较浅，其后紧接着2～3个线粒体分布在鞭毛周围；鞭毛从头部后端的正中向后伸出（图1-5）。头部长径为2.83～3.24 μm，短径为1.38～1.60 μm，尾部鞭毛长19.57～27.98 μm。

2.2透射电子显微镜观察

2.2.1云斑尖塘鳢精子由头部、中段（颈部）和尾部（鞭毛）3部分组成。（1）头部细胞核纵切面呈扁卵圆形，细胞核的后端正中有很浅的植入窝。核膜与质膜间存在着较小的间隙，细胞质膜表面呈凹凸不平状。核内的染色质呈颗粒状或短棒状。染色质中可见到数量很少的空隙（即核泡）。（2）中段（颈部）较短且不太明显，其主要结构是中心粒复合体（即近端中心粒和远端中心粒）及袖套。近端中心粒长轴与远端中心粒垂直，呈“T”字形。袖套中含有线粒体6～7个，呈单层环状排列。线粒体内可见清晰的线粒体嵴。在袖套的纵切面可见2～4个圆形线粒体（图2-1），而横切面可见6～7个线粒体（图2-2）。（3）尾部（鞭毛）细长，从头部后端很浅的植入窝伸出。鞭毛的轴丝具有典型的“9+2”型结构（图2-3），外周是9组二联微管，中央是1组微管对。在鞭毛的横切面上可见轴丝两侧具有发达的侧鳍，侧鳍的基部有囊泡[2]。

2.2.2线纹尖塘鳢精子由头部、中段和尾部组成。（1）头部纵切面呈卵圆形，后端正中有较浅的植入窝。细胞质膜表面不平整，核膜与质膜间的间隙较小，其间分布有细胞质、囊泡、溶酶体等。核内染色质致密，呈颗粒或短棒状。（2）中段较短且不明显，主要包括中心粒复合体和袖套。袖套紧接于细胞核的后端，呈短圆筒状，两边对称，袖套中含有线粒体 7～8个，呈单层环状排列，线粒体内的线粒体嵴清晰可见。袖套的纵切面可见3～4个圆形线粒体（图2-4），而横切面可见7～8个线粒体（图2-5）。（3）尾部细长，从植入窝中伸出，鞭毛的轴丝具有典型的“9+2”型结构，其横切面可见轴丝两侧发达的侧鳍。

2.2.3河川沙塘鳢精子由头部、中段和尾部组成。（1）头部细胞核纵切面呈前端略方的长椭圆形，头部后端正中部位有1个较浅的植入窝，凹陷约为头部的1/6（图2-6）。核膜与质膜间有小间隙，核内的染色质致密呈颗粒状，染色质中可见到数量较少的空隙。（2）中段较短且不太明显，主要包含中心粒复合体和袖套。袖套中含有线粒体2～3个，环状排列在轴丝周围，线粒体内可见清晰的线粒体嵴。在精子的纵切面可见2个圆形线粒体（图2-6），在袖套的横切面可见2个线粒体（图2-7）。（3）尾部细长，从头部后端较浅的植入窝伸出。鞭毛的轴丝具有典型的“9+2”型结构，在鞭毛的横切面上可见轴丝两侧具有发达的侧鳍。

2.2.4鸭绿沙塘鳢精子由头部、中段和尾部构成。（1）头部纵切面呈长椭圆形，前端一侧略方。头部后端正中部位有1个较浅的植入窝，凹陷为头部的1/5～1/4。核膜与质膜间有小间隙，核内的染色质致密，呈颗粒状，染色质中可见到少量的空隙。（2）中段较短且不明显，包括中心粒复合体和袖套。袖套中含有线粒体2～3个，环状排列呈1圈，线粒体内可见清晰的线粒体嵴。在精子的纵切面可见2个圆形线粒体（图2-8）。③尾部细长，从头部后端伸出。鞭毛的轴丝由远端中心粒向外延伸，具有典型的“9+2”型结构，轴丝两侧具有侧鳍。

3讨论

通过对云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、河川沙塘鳢、鸭绿沙塘

鳢精子的超微结构进行比较， 发现它们有以下相同点和不同之处。相同的是，在扫描电镜下观察，精子均由头部和尾部（鞭毛）构成。在透射电镜下观察，精子均由头部、中段和尾部构成，中段较短且不太明显；精子头部的前端均没有顶体结构；尾部轴丝均具有典型的“9+2”型结构；精子鞭毛的轴丝两侧均具有发达的侧鳍。不同的是，在扫描电镜下云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢精子头部均呈圆球形，而河川沙塘鳢和鸭绿沙塘鳢精子头部呈前端略方的长椭圆形；云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢头部细胞核中染色质致密，只见到数量很少的空隙（即核泡），鸭绿沙塘鳢染色质中见到的核泡稍多些，而河川沙塘鳢中见到的核泡则相对较多；在透射电镜下，云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢的袖套中含有线粒体数量较多（为6～8个），呈单层环状排列，而河川沙塘鳢及鸭绿沙塘鳢袖套中仅含有线粒体2～3个，排列在轴丝的周围；云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢的植入窝最浅，河川沙塘鳢的植入窝较浅，凹陷约为头部的1/6，鸭绿沙塘鳢的植入窝相对较深，凹陷为头部的1/5～1/4；从精子的鞭毛长度来看，河川沙塘鳢最长（27.45～36.42 μm）、云斑尖塘鳢次之（23.22～32.92 μm），鸭绿沙塘鳢再次之（19.57～27.98 μm），线纹尖塘鳢最短（16.01～25.32 μm），但均比同为塘鳢科的中华乌塘鳢精子的鞭毛（15.5～17.5 μm）[3]要长。比较这4种虾虎鱼类精子的超微结构发现，同属中2种虾虎鱼类的精子超微结构相似，而不同属的虾虎鱼类间精子超微结构存在较大差异，这与同属的鱼类亲缘关系较近相一致。

在云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢精子的超微结构中可以看到，与大多数硬骨鱼类一样，精子头部前端均无顶体结构[4]。在透射电镜下4种虾虎鱼类精子头部呈扁卵圆形或椭圆形，这与大多数体外受精硬骨鱼类的精子头部相近，如草鱼和兴国红鲤[5]，而与江黄颡鱼[6]不同，其精子头部呈马鞍形。对黄颡鱼[7]和长吻[8]的研究发现，它们均具有非常发达的植入窝，黄颡鱼的植入窝呈井状，长吻的植入窝极深，凹入深度约为精子头部长径的5/6，而4种虾虎鱼类精子头部的植入窝均较浅。在长吻[8]和褐菖鲉[9]中，其袖套中分别含有16个或30～40个线粒体，且呈多层排列，而4种虾虎鱼类精子的袖套线粒体数量较少，且呈单层排列。4种虾虎鱼精子的鞭毛轴丝均具有典型的“9+2”型双联管结构，而长薄鳅等[10]的尾部则为“9+3”式微管结构。与黄颡鱼[7]、长吻[8]、褐菖鲉[9]等相同，这4种虾虎鱼类精子的尾部轴丝两侧都有比较发达的侧鳍，而有些鱼类的精子则无侧鳍，如鲤鱼[11]、刀鲚[12]等。鞭毛是精子的运动器官，Stoss[13]认为侧鳍可能改善精子鞭毛的游泳速率，有利于提高受精率，而Afzelius[14]则认为侧鳍与精子游泳速率的提高无多大关系，侧鳍的有无是否影响精子的游泳速率，从而影响受精效率，不同学者存在不同的看法。

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