非小细胞肺癌组织BCRP、LUNX mRNA表达变化及意义

张杨，王刚，陈侠，张云志，秋彤，高飞

陕西中医药大学第二附属医院，陕西咸阳712000

流行病学调查显示，非小细胞肺癌（NSCLC）发病率约占肺癌的80.0%［1-2］。肺癌根治术是目前Ⅰ～Ⅲa期NSCLC 的主要治疗手段，但仍有25.0%～30.0%的患者术后会发生局部复发或远处转移，且术后5年生存率仅50%～70%［3-4］。肺组织特异度蛋白X（LUNX）是肺组织特异性表达基因，在肺癌组织中呈特异性高表达［5］。乳腺癌耐药蛋白（BCRP）在调节细胞周期、转录、泛素化及细胞凋亡等方面具有重要作用，其功能缺失可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［6］。本研究观察了 NSCLC 组织 BCRP、LUNX mRNA 的表达变化，并探讨其在NSCLC 诊断、疾病进展评估及预后判断中的作用。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取 2013 年 3 月—2016 年 3 月我院收集的NSCLC组织54例份作为观察组，患者均符合《2015 SCAN 指南：晚期非小细胞肺癌的系统治疗》［7］中的NSCLC诊断标准，并经病理组织学检查证实为NSCLC，预计生存时间＞4 个月；排除近期有放化疗治疗史者，合并恶性心包积液或胸腔积液者，合并肺结核、肺大疱、急性肺部感染或气胸者，重度失语症、阿尔茨海默病或精神行为异常者。另选取正常肺组织24例份作为对照组。观察组患者男35例、女19例，年龄37～74（51.82± 6.01）岁，BMI 17.30～26.30（22.90± 1.35）kg/m2。对照组患者男15例、女9例，年龄 35～72（52.23 ± 5.93）岁，BMI 17.00～26.50（23.08±1.40）kg/m2。两组患者一般资料均具有可比性（P均＞0.05）。本研究通过医院伦理委员会审核，患者或家属均签署知情同意书。

1.2 组织BCRP、LUNX mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。取两组组织，TRIzol 试剂提取总RNA，并采用琼脂糖凝胶电泳分析总RNA完整性，检测总RNA浓度、纯度合格后，应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription 试剂盒逆转录已定量RNA 为cDNA。BCRP引物序列：上游引物5'-CTGAGATCCT⁃GAGCCTTTGG-3'、下 游引 物 5'-TGCCCATCACAA⁃CATCATCT-3'，内参基因GAPDH 引物序列：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'、下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。LUNX 引物序列：上 游 引 物 5′-CTCATTGTCTTCTACGGGCTGTTAG-3'、下游引物 5'-CTTTATGCCGAGAGGGATGGT-3'，内参基因GAPDH 引物序列：上游引物5'-ACAGT⁃CAGCCGCATCTTCTTT-3'、下游引物 5'-CCATCAC⁃GCCACAGTRCC-3'。PCR反应体系25 µL：PCR reac⁃tion m ixture 12µL，特异性上、下游引物（10 pmol/µL）各1 µL，cDNA 模板 1 µL，加水补足25 µL。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，反复32 个循环，最终72 ℃延伸 8 min。采用 2－ΔΔCt法计算 BCRP、LUNX mRNA 相对表达量。

1.3 预后随访方法 采用电话或住院病历随访等方式对观察组患者进行随访，随访时间截至2020 年3月，记录患者中位生存时间。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以±s表示，结果比较采用t检验；计数资料以例或率表示，结果比较采用χ2检验。观察组BCRP、LUNX mRNA 表达量的关系采用Spearman 相关性分析。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析BCRP、LUNX mRNA 单一及联合诊断NSCLC 的价值。以BCRP、LUNX mRNA 表达量中位数为界限，≤中位数为低表达者，＞中位数为高表达者，绘制BCRP、LUNX 高表达者与低表达者的Kaplan-Meier 生存曲线，采用Log-Rank检验比较其生存时间。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组组织BCRP、LUNX mRNA 相对表达量比较 观察组与对照组BCRP mRNA 相对表达量分别为0.60± 0.27、0.19 ± 0.09，LUNX mRNA 相对表达量分别为12.94±2.10、9.41±4.25；两组比较P均＜0.05。观察组BCRP、LUNX mRNA 相对表达量呈正相关关系（r=0.426，P＜0.01）。

2.2 BCRP、LUNX 单一及联合诊断 NSCLC 的价值比较 见表1。

表1 BCRP、LUNX单一及联合诊断NSCLC的价值比较

2.3 观察组不同临床病理参数患者癌组织BCRP、LUNX mRNA表达比较 见表2。

2.4 观察组BCRP、LUNX 高低表达患者的预后比较 观察组BCRP高表达28例、低表达24例，其中位生存时间分别为 26、45 个月，二者比较P＜0.05。LUNX高表达30例、低表达24例，其中位生存时间分别为35、48 个月，二者比较P＜0.05。观察组BCRP、LUNX高低表达患者的生存曲线见图1。

3 讨论

肿瘤转移是导致NSCLC 患者治疗失败及死亡的主要原因［8-9］。受化疗药物高毒性及耐药性影响，NSCLC患者的中位生存期不甚理想［10-11］。同时，CT、病理检查、磁共振成像等常规检查方法难以有效检出肿瘤转移。因此，研究NSCLC 发生、进展及转移的分子机制，寻找相关生物学标志物是现阶段肿瘤学研究领域热点之一。越来越多研究证实，微转移是肿瘤患者预后不良的独立危险因素，而淋巴结微转移是NSCLC 患者预后不良的主要原因［12-13］。LUNX 在NSCLC 组织中特异表达，既往研究认为LUNX 可作为预测NSCLC 转移或复发的指标，可辅助诊断NSCLC 微转移［14］。但本研究结果表明，癌组织中LUNX mRNA表达与NSCLC患者的性别、年龄、组织学分型、临床分期、分化程度、淋巴结转移均无明显相关性，其原因可能与LUNX 表达主要来源于转移的癌细胞有关。本研究结果显示，LUNX 高表达患者的生存时间明显短于低表达患者。赵霞等［15］以87 例NSCLC 患者为研究对象，随访显示LUNX mRNA 高表达患者中位生存期仅34.36 个月，是影响NSCLC 患者预后的独立危险因素。这提示LUNX可作为判断NSCLC 预后的新靶点。分析原因，LUNX mRNA 表达上调可增加肿瘤负荷，破坏机体防御肿瘤浸润的自然屏障，从而加重肿瘤细胞浸润，提高NSCLC患者术后转移或复发风险。

表2 观察组不同临床病理参数患者癌组织BCRP、LUNX mRNA表达比较（±s）

表2 观察组不同临床病理参数患者癌组织BCRP、LUNX mRNA表达比较（±s）

临床病理参数性别男 女年龄（岁）≥50＜50组织学分型鳞癌腺癌临床分期Ⅰ期Ⅱ、Ⅲ期分化程度高分化中、低分化淋巴结转移是 否n 35 19 41 13 22 32 29 25 30 24 24 30 BCRP mRNA相对表达量0.63±0.24 0.54±0.21 0.62±0.25 0.54±0.23 0.61±0.31 0.59±0.26 0.65±0.26 0.54±0.28 0.69±0.22 0.50±0.19 0.59±0.27 0.61±0.32 t 1.373 1.024 0.257 1.496 3.347 0.244 P 0.176 0.311 0.798 0.141 0.002 0.808 LUNX mRNA相对表达量12.08±4.38 14.52±5.14 12.85±3.69 13.22±4.14 11.56±6.74 13.58±6.14 12.02±5.74 14.17±7.19 14.18±6.28 12.14±4.17 12.12±3.47 13.40±6.25 t 1.839 0.306 1.142 1.221 1.367 0.898 P 0.072 0.761 0.259 0.227 0.178 0.374

图1 观察组BCRP、LUNX高低表达患者的生存曲线

BCRP 是细胞内的重要衔接蛋白，主要受整合素信号途径调控，参与氨基酸、毒素、糖等转运，在乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤等多种肿瘤中呈高表达［16-17］。研究表明，BCRP 通过与细胞表面生长因子受体结合，可刺激细胞表面生长因子受体活化，抑制NSCLC 癌细胞凋亡；同时BCRP还能发生突变，帮助细胞逃避凋亡，诱导Grb2 与Shp-2 结合，刺激Ras/Raf/丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号途径，从而导致癌细胞异常增殖［19］。本研究结果显示，NSCLC 组织中 BCRP mRNA 表达量明显高于正常肺组织，且NSCLC 组织中BCRP表达与分化程度有关，推测BCRP可能参与了NSCLC 的发生、发展过程。BCRP 可直接参与v-Crk 及 v-Src 癌蛋白信号通路，上调 p-p38 表达，影响癌细胞生长、分化；同时可以促进致癌性转化，进而增强癌细胞转移及侵袭能力，诱导肿瘤分化，加重肿瘤恶性程度，明显增加转移复发风险。本研究结果显示，BCRP 高表达患者的生存时间明显短于低表达患者，提示可作为评估NSCLC 患者预后的潜在预测因子，为肿瘤靶向治疗提供新方向。分析原因，BCRP 表达上调一定程度上会特异性转运甲氨蝶呤、米托蒽醌等多种抗肿瘤药物，强化抑制胱门蛋酶及化疗药物诱导凋亡活性，增强肿瘤细胞耐药性，参与原发性耐药的形成［18-19］。同时，本研究显示BCRP mRNA 单独诊断的NSCLC 灵敏度偏低（46.30%），而BCRP、LUNX mRNA 联合诊断 NSCLC 的 AUC 最大（0.824），灵敏度可达70.37%，提示BCRP、LUNX 联合检测在NSCLC诊断方面具有良好的应用前景。

综上所述，NSCLC 组织中 BCRP、LUNX 表达均升高，且BCRP 高表达与肿瘤分化程度有关，二者联合检测有助于NSCLC 患者的诊断和预后判断，有望成为NSCLC诊断及预后判断的新靶点。