动脉粥样硬化兔血清、外周血单核细胞、主动脉组织B7-H3、B7-H4表达变化及意义

李志乐，韦秋宇，言纬，刘莉，黄照河，韦宝敏

右江民族医学院附属医院，广西百色533000

动脉粥样硬化（AS）是心血管疾病的始动环节与病理基础，慢性炎症反应参与其发生发展的过程［1］。炎症反应过程中可释放细胞因子和炎症细胞，导致斑块破裂、血栓形成，从而参与了AS 的发生。白细胞介素1β（IL-1β）和γ-干扰素（IFN-γ）均是促进AS 发生发展的炎性因子［2-3］，而白细胞介素10（IL-10）可通过抗炎及调控线粒体自噬发挥抑制AS 的作用［4］。B7-H3、B7-H4 是近年新发现的 B7 家族成员，作为负性协同刺激因子能抑制CD4+和CD8+T 淋巴细胞的活化与增殖［5-6］。目前，关于B7-H3、B7-H4 的生物学效应机制仍有争议，其在AS 发生发展中的炎症调节机制还有待进一步研究。2018年 9 月—2020 年 6 月，本研究观察了 AS 兔血清、外周血单核细胞、主动脉组织中协同刺激因子B7-H3、B7-H4 的表达变化，并分析其与IL-10、IL-1β、IFN-γ表达的关系，为探索B7-H3、B7-H4影响AS发生发展的相关机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：成年健康新西兰大白兔20只，清洁级，雄性，3 月龄，体质量2.0～2.5 kg；实验动物许可证号：SCXK 桂2012-0003，购自右江民族医学院实验动物中心。主要药物及试剂：胆固醇购自安徽天启化工公司，蛋黄粉购自毫州市红日实业有限公司；ELISA 试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司，TRIzol试剂盒购自美国Invitrigen 公司，逆转录试剂盒购自上海睿时生物科技有限公司，Real Master Mix试剂盒购自北京TIANGE公司。

1.2 动物分组、造模与标本获取 选取20 只成年健康雄性新西兰大白兔，采用随机数字表法分为AS组和对照组，各10 只。AS 组持续给予高脂饮食14周，对照组给予普通饮食14周，高脂饮食由3.0%胆固醇、8.5%蛋黄粉、8.5%猪油和80%普通动物饲料制成。实验前后0周、14周采集兔耳缘静脉血，14周末处死并留取主动脉，部分行主动脉病理检测，剩余置于液氮中行PCR检测。

1.3 血脂水平检测 两组分组处理前（0周）和分组处理14周末，在空腹情况下，分别采集兔耳缘静脉血2 mL，静置30 min后3 000 r/min离心15 min，分离血清。采用7170 型全自动生化分析仪检测血脂水平，包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。

1.4 主动脉形态及病理观察 采用HE 染色。两组分组处理14 周末，采集耳缘静脉血后进行处死。分离兔主动脉弓起始处至胸主动脉段，生理盐水冲洗并分离主动脉，剪取同一部位0.5～1.0 cm 长的血管段，置于10%缓冲甲醛液中固定24 h，石蜡包埋，剩余置于液氮中保存备用。取石蜡标本，血管横断面连续切片，厚度约为5µm，常规进行HE 染色。DMR+550 型病理图像分析仪测定粥样斑块最大横截面积、主动脉横截面积和内膜厚度，斑块面积比=粥样斑块最大横截面积/主动脉横截面积×100%。将剩余的主动脉从背侧面纵行正中线剪开、铺平，用NIKON100 对铺平的主动脉进行摄像，将照片输入计算机，观察脂质条纹、斑块破裂及血栓形成等病理情况。

1.5 血清炎性因子及sB7-H3、sB7-H4水平检测 采用ELISA 法。取1.3 中分离的血清，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，检测两组血清炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-10及sB7-H3、sB7-H4水平。

1.6 外周血单核细胞与主动脉组织B7-H3、B7-H4 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。两组分组处理14周末，采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞。取两组外周血单核细胞及液氮冻存的主动脉组织，采用TRIzol 法提取总RNA，测定260、280 nm 处的光密度值及其完整性，逆转录合成cDNA。采用ABI7500 实时荧光定量PCR 仪进行PCR 反应。B7-H3、B7-H4 及内参 β-actin 引物序列见表1。PCR反应条件：95 ℃预变性 2 min；95 ℃、15 s，58 ℃、15 s，68 ℃、31 s，共 45 个循环扩增。采用 2－ΔΔCt法计算B7-H3、B7-H4 mRNA相对表达量。

表1 B7-H3、B7-H4及内参β-actin引物序列及扩增长度

1.7 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计量资料以-x±s表示，结果比较采用t检验；血清sB7-H3、sB7-H4 与 IL-1β、IFN-γ、IL-10 的关系采用Pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组兔不同时间点血脂水平比较 见表2。

表2 两组兔不同时间点血脂水平比较（mmol/L，±s）

表2 两组兔不同时间点血脂水平比较（mmol/L，±s）

注：与同组0周比较，*P＜0.05；与对照组同时间点比较，#P＜0.05。

组别AS组0周14周对照组0周14周n 10 10 TC 1.04±0.22 28.29±5.50*#0.98±0.25 1.37±0.34 TG 0.75±0.11 2.79±0.36*#0.78±0.09 0.87±0.15 LDL-C 0.82±0.26 30.36±2.71*#0.80±0.32 0.85±0.27 HDL-C 1.83±0.27 1.37±0.37*#1.75±0.12 1.82±0.33

2.2 两组兔主动脉形态及病理比较 ①主动脉形态：对照组兔主动脉内膜光滑、平坦、完整。AS组兔主动脉病灶呈弥漫性、颗粒状及息肉状，甚至不规则改变，较严重者斑块融合成片，可见脂样物质突出管腔，边缘粗糙。②主动脉病理改变：对照组兔主动脉壁结构清晰，内膜、中膜及外膜组织结构正常，光滑完整。AS 组主动脉内膜明显增生增厚，血管内膜下可见泡沫细胞与脂质沉积，形成粥样脂质斑块，局部钙化，中膜平滑肌细胞增生，呈典型AS 病理改变。AS 组兔斑块面积比 为 66.82% ± 15.45%、内 膜 厚 度（86.02 ±12.32）µm，对照组分别为 0、（8.12 ± 3.85）µm；两组比较P均＜0.05。

2.3 两组兔血清 IL-1β、IFN-γ、IL-10 及 sB7-H3、sB7-H4水平比较 14周时，AS组兔血清IL-1β、IFN-γ 水平均高于同组0周及对照组同时间点，而IL-10、sB7-H3 及sB7-H4 水平均低于同组0 周及对照组同时间点（P均＜0.05）。见表3。

表3 两组兔血清IL-1β、IFN-γ、IL-10及sB7-H3、sB7-H4水平比较（ng/L，-x± s）

2.4 两组兔外周血单核细胞与主动脉组织B7-H3、 B7-H4 mRNA表达比较 见表4。

表4 两组兔外周血单核细胞与主动脉组织B7-H3、B7-H4 mRNA表达比较（±s）

表4 两组兔外周血单核细胞与主动脉组织B7-H3、B7-H4 mRNA表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别AS组对照组n 10 10 B7-H3单核细胞0.533±0.182*0.958±0.206主动脉0.516±0.165*0.899±0.192 B7-H4单核细胞0.612±0.204*0.983±0.175主动脉0.497±0.216*0.862±0.163

2.5 血清B7-H3、B7-H4 与IL-1β、IFN-γ、IL-10 的相关性分析结果 血清sB7-H3与IL-1β、IFN-γ 均呈负相关关系（r分别为-0.554、-0.534，P均＜0.05），与IL-10 呈正相关关系（r=0.692，P＜0.05）。血清sB7-H4 与 IL-1β、IFN- γ 均 呈 负 相 关 关 系（r分 别为-0.485、-0.466，P均＜0.05），与IL-10 呈正相关关系（r=0.676，P＜0.05）。

3 讨论

目前认为，AS是一种以剧烈的免疫活动为特征的慢性炎症性疾病，由单核细胞、巨噬细胞、T 细胞等多种免疫细胞参与，因此炎症免疫反应在AS的发生、发展中发挥重要作用［7］。研究发现，自身免疫性疾病可导致心血管疾病的发病率和病死率增加，系统性红斑狼疮患者颈动脉粥样硬化发病率约为健康对照组的2 倍，这可能与免疫功能失调和慢性炎症等因素有关［8-9］。CD4+T 细胞诱导的抗原特异性免疫反应是近年来AS 炎症反应机制中的一个研究热点。B7 家族是免疫球蛋白超家族，B7-H3 是新发现的B7家族成员，与慢性炎症性疾病的发生发展密切相关，在高血压合并颈AS 患者中呈高表达［10］。B7-H4 是另一个新发现的B7 家族成员，能抑制CD4+和CD8+T 细胞增殖，减少炎性因子产生，进而负性调控T淋巴细胞的免疫应答［11-12］。目前，协同刺激分子B7-H3、B7-H4在免疫调节方面的生物学功能已经成为当今研究的热点，但其在AS炎症反应中的作用鲜见报道。

本研究对大白兔给予高脂饮食14 周后，AS 组兔血清TC、TG 及LDL-C水平较同组0周及对照组同时间点均明显升高，而HDL-C 水平显著低于同组0周及对照组同时间点；在主动脉形态学方面，AS 组兔主动脉病灶呈弥漫性，呈灰白色颗粒状、息肉状、不规则或椭圆形，较严重者斑块融合成片，可见脂样物质突出管腔，边缘粗糙；在主动脉病理学方面，AS组兔主动脉内膜明显增生增厚，血管内膜下可见泡沫细胞与脂质沉积，形成粥样脂质斑块，局部钙化，中膜平滑肌细胞增生，呈典型AS 的病理改变；且AS组兔主动脉内膜厚度与粥样斑块面积比均明显高于对照组，证实成功构建AS兔模型。

既往研究表明，IL-10 作为抗AS 的炎性因子，由Th2 细胞分泌，可抑制巨噬细胞释放炎症介质，具有逆转与稳定AS斑块的作用［13］。另有研究发现，人类抗原呈递细胞中B7-H4 表达显著增强，是通过IL-10自分泌的方式刺激导致的，提示IL-10 参与上调B7-H4 表达［14］；同时，B7-H3、B7-H4 也可通过促进 IL-10分泌的方式抑制炎症反应［15］。这提示在AS 进展过程中，B7-H3、B7-H4可能通过促进IL-10分泌介导抗AS 炎症反应。IL-1β、IFN-γ 均是参与介导体液免疫反应而促进AS 进展的炎性因子，主要由巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞产生，通过炎症小体的组装介导 Caspase-1 激活，从而调控炎症反应［16-17］。动物实验表明，B7-H3可抑制IL-1β、IFN-γ 等炎性因子的分泌与激活，而IL-1β、IFN-γ 在 B7-H4-/-小鼠中的表达明显升高。临床研究表明，抑制IL-1β 表达可治疗多种慢性炎症性疾病，表明IL-1β 可作为临床上AS 抗炎治疗的潜在靶点［18］。本研究结果显示，AS组14 周兔血清sB7-H3、sB7-H4 水平及外周血单核细胞和主动脉B7-H3、B7-H4 mRNA 表达较对照组均明显下降，而血清IL-1β、IFN-γ 水平上调，进一步行Pearson 相关分析结果显示，血清sB7-H3、sB7-H4分别与IL-1β、IFN-γ 呈负相关关系。由此我们推测，B7-H3、B7-H4可能通过介导抑制IL-1β、IFN-γ表达来抗AS 炎症反应，而IL-10 可抑制T淋巴细胞凋亡，减少IL-1β、IFN-γ 等炎性因子的分泌，抑制炎性反应，减轻炎症对血管的损伤。协同刺激因子B7-H3、B7-H4 在AS 炎症反应过程中起到中枢调节作用，可能通过促进 IL-10 分泌及抑制IL-1β、IFN-γ 表达，以减轻AS炎症反应，为AS炎性反应中的保护性因子。

综上所述，AS兔血清、外周血单核细胞、主动脉组织协同刺激分子B7-H3、B7-H4 表达均降低，B7-H3、B7-H4 可减轻AS 炎症反应，其机制可能与促进IL-10分泌及抑制IL-1β、IFN-γ表达有关，B7-H3、B7-H4有望成为AS防治的新靶点。