水样中5种氟喹诺酮的UPLC-QTOF法测定

李金玲， 杨愿愿， 刘思思， 赵建亮， 应光国， 陈长二

(教育部环境理论化学重点实验室∥广东省化学品污染与环境安全重点实验室∥华南师范大学环境学院， 环境研究院， 广州 510006)

中国是世界上最大的抗生素生产和使用国[1]. 据估计，我国抗生素年使用量超过1.6×105t[2]，然而药用抗生素只有少部分可以被机体吸收利用[3]，大部分会以药物原形或代谢产物的形式进入环境[4-5]. 抗生素一旦进入环境，可能通过食物链进行传递[6]，进而对人类和动物健康以及生态环境造成极大的威胁[7-8]. 另一方面，在低浓度长期暴露下，抗生素还会诱导产生抗性基因[9]. 因此，了解抗生素在环境中的赋存水平，可以为相关环境部门评估抗生素生态风险与管理抗生素的使用提供强有力的数据支撑.

氟喹诺酮类抗生素(FQs)是在喹诺酮类抗生素主环的6位或8位加上1个F原子衍生而来[10]，因其具有广谱性、抗菌性强等优点而被广泛应用，导致其在环境中有较高的检出率和检出浓度[11]. 目前，环境样品中FQs的定量方法主要有高效液相色谱法[12-14]、液相色谱-质谱联用法[15-17]、酶联免疫分析法[18-19]等. 但是在复杂的基质干扰下，对目标污染物的准确检测要求仪器有较高的选择性和灵敏度，电喷雾离子源高分辨飞行时间质谱可提供目标物母离子和碎片离子的精确质量数，不仅提高了目标物定性筛查的可靠性，也可获得较高灵敏度的定量数据.

本文利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF)在电喷雾正离子条件的3种模式：MS(Mass Scan)、MSE、MRM(Multiple Reaction Monitoring)，建立同时测定5种FQs的定量分析方法，并与超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UPLC-TQMS)的方法进行比较研究.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-四极杆串联时间飞行质谱仪(UPLC-QTOF，美国Waters)，配有电喷雾离子源；超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC-TQMS，美国Waters)，配有电喷雾离子源；PURELAB flex纯水仪(英国ELGA)；玻璃纤维滤膜(GF/F，0.7 μm, 英国Whatman)；Oasis 亲水亲油平衡(Hydrophilic Lipophilic Balance,HLB)固相萃取柱(500 mg，6 mL，美国Waters);甲醇、乙腈(HPLC级，德国Merck)；HPLC级甲酸(HPLC级，阿拉丁)；本实验用水均为超纯水(18.2 MΩ·cm).

标准品：环丙沙星(Ciprofloxacin，CFX)、恩诺沙星(Enrofloxacin，EFX)、诺氟沙星(Norfloxacin，NFX)、氧氟沙星(Ofloxacin，OFX)、培氟沙星(Pefloxacin，PFX)和内标环丙沙星-D8(Ciprofloxacin-D8，CFX-D8)均购于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH. 所有标准品纯度均不低于98%(质量分数).

标准溶液的配制：准确称取适量各标准品，并用甲醇溶解配制成质量浓度为100 mg/L的单一标准储备液，放入-20 ℃低温的冰箱中避光保存.

1.2 质谱方法的建立

1.2.1 UPLC-QTOF方法 将质量浓度为100 μg/L的各化合物单标分别在UPLC-QTOF上进行一级质谱全扫描，分析得到母离子，并在高能量通道扫描其二级质谱. 随后，在MRM模式下优化5种FQs的特征离子对、毛细管电压、碰撞能等质谱参数，选取响应强、干扰小的离子作为定量和定性离子.

1.2.2 UPLC-TQMS方法 将各FQs的单标标准品在全扫描模式下直接进样，并利用MassLynx4.1软件中质谱参数优化的功能，确定各目标化合物的最优碰撞能、锥孔电压等参数.

1.3 色谱方法的建立

色谱柱选用Waters ACUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm). 在低pH条件下可保持FQs在流动相中稳定的溶解状态，采用甲酸来控制流动相的pH，比较甲醇和乙腈作有机相时，目标物色谱峰的峰形、响应强度以及分离度. 此外，本文考察了0.1%(体积分数，全文同)甲酸水-甲醇、0.2%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇作为流动相时对目标物峰形和响应值的影响. 随后，调节流动相初始体积比和洗脱梯度，确定最佳液相测试方法.

柱温不仅会影响目标化合物的保留时间，也会影响目标物的分离和响应. 比较不同柱温(30、40、50 ℃)对目标化合物响应强度的影响.

在UPLC-TQMS上直接应用UPLC-QTOF确定的色谱柱、流动相及液相洗脱方法，并适当优化洗脱梯度，以使目标化合物的响应和峰形更好.

1.4 方法性能的比较

1.4.1 线性关系 将标准储备液逐级稀释，配制成质量浓度为0.5、1、5、10、20、50、100 μg/L的混合标准溶液，按照优化后的色谱-质谱条件测定，使用内标法定量. 以目标物定量离子与内标定量离子的峰面积之比为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线.

1.4.2 定量限、检出限及数据存储大小比较 为测定仪器检出限和定量限，将低浓度的混标工作液(7个平行样)在2台仪器的各个模式下分别连续测定，同时准备7组甲醇溶液，按以上步骤测定. 通过几次测定结果的标准偏差，计算仪器检出限和定量限[20]. 此外，比较UPLC-QTOF的3种质谱采集模式下和UPLC-TQMS的MRM模式下，测定1个样品所需的数据存储空间.

1.4.3 仪器的精密度 对低、中、高质量浓度的FQs混标工作液重复测定6次，根据6次重复测定数据的相对标准偏差来考察仪器的精密度.

1.5 方法应用

于广东省茅洲河上游和中游分别采集3个1 L水样，加入0.4 mL 4 mol/L硫酸以调节pH，加入50 mL甲醇抑制微生物的生长. 上游和中游样品分别命名为样品1、2. 将水样置于含有冰袋的采样箱，迅速运回实验室. 参照文献[21]的方法，将1 L水样过玻璃纤维滤膜，加入100 μL 1 mg/L CFX-D8内标，混匀后采用固相萃取法提取水样中抗生素. 依次用10 mL甲醇和10 mL超纯水活化HLB萃取柱，将过滤后的水样以5～10 mL/min的流速加载于固相萃取柱，样品瓶用50 mL 5%甲醇水润洗2次. 用10 mL 超纯水清洗小柱，对萃取柱真空抽干2 h，用10 mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液，用氮气吹干，用1 mL初始流动相复溶，采用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，将滤液分别在2台仪器各模式下进行检测.

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

2.1.1 UPLC-QTOF质谱条件 优化的质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压为2.0 kV，锥孔电压为40 V，离子源温度为120 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃，脱溶剂气流速为800 L/h，锥孔气流速为50 L/h；扫描模式MS/MSE/MRM，质荷比m/z范围为50～1 200；Lockmass为亮氨酸脑啡肽(2 μg/L)溶液；采集时间0.5 s，采集间隔时间10 s，扫描精确质荷比为556.277. 5种FQs在该仪器上的质谱采集参数见表1. UPLC-QTOF所采集目标物的相对分子质量偏差均小于±0.3 mDa，表明该仪器可提供较精确的质荷比，可为复杂环境基质样品的准确定量分析提供条件.

表1 不同FQs在UPLC-QTOF上的质谱采集参数Table 1 The parameters of different FQs detection under UPLC-QTOF

2.1.2 UPLC-TQMS的质谱条件 采用电喷雾离子源、正离子模式；毛细管电压为2.0 kV，锥孔电压为40 V；离子源温度为120 ℃，脱溶剂气温度为300 ℃；脱溶剂气流速为800 L/h，锥孔气流流速为150 L/h；扫描模式为MRM. FQs结构中含有羧基和氨基，当溶液为酸性时，其呈现阳离子状态，并在ESI+模式下，易形成[M+H]+准分子离子，可作为母离子. 5种FQs及其内标在该仪器上的质谱采集参数见表2.

2.2 液相条件的优化

2种仪器优化后的液相条件：柱温为40 ℃，样品室温度为10 ℃，进样体积为5 μL. 流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为甲醇. 梯度洗脱程序设置为：(1)UPLC-QTOF：0～2.5 min，20% B；2.5～2.6 min，20%～100% B；2.6～3.6 min，100% B；3.6～3.7 min，100%～20% B；3.7～4.5 min，20% B. 流速为0.5 mL/min. (2)UPLC-TQMS：0～2.5 min，10% B；2.5～2.6 min，10%～100% B；2.6～3.6 min，100% B；3.6～3.7 min，100%～10% B；3.7～4.5 min，10% B. 流速为0.5 mL/min.

表2 不同FQs在UPLC-TQMS上的质谱采集参数

与乙腈相比，当有机相为甲醇时，色谱峰的分离度更高，且由于甲醇在氢键作用下是较强的质子供体，可提高目标物的灵敏度. 不同的酸度会对目标物离子化效果、峰形和响应强度造成影响. 甲酸的加入不仅使其峰形更加对称和尖锐，且利于FQs的离子化，得到较强的响应. 以环丙沙星为例，在不同流动相条件下的色谱峰见图1A. 0.1%甲酸水溶液-甲醇流动相为本实验最优流动相，用于后续实验. 目标化合物的响应强度随柱温的升高而增强(图1B)，考虑到柱温对色谱柱寿命的影响，故选取40 ℃作为最佳柱温. 图2为环丙沙星在UPLC-QTOF上的3种模式(MSE、Full scan、MRM)和UPLC-TQMS的MRM模式下定量离子的色谱图.

图1 不同流动相条件及柱温对环丙沙星色谱峰的影响

图2 环丙沙星在UPLC-TQMS和UPLC-QTOF模式下定量离子的色谱图

2.3 线性关系

2台仪器各个采集模式下，目标物的线性范围、线性方程见表3和表4，各模式下目标物线性方程的相关系数(R2)均大于0.99，表明其在相应的范围内有良好的线性关系. 崔敬鑫等[22]研究中FQs的线性范围为5～100 μg/L，本文方法的线性范围与其方法的线性范围相当.

2.4 检出限、定量限及数据量比较

在UPLC-TQMS上，目标物的检出限和定量限分别为0.08～0.10 μg/L和0.32～0.92 μg/L，在UPLC-QTOF上，检出限和定量限为0.04～0.22 μg/L和0.17～0.90 μg/L，2台仪器均显示出较高的灵敏度. 对比其他文献报道的方法[23]，本方法对目标物的检出限与定量限均低于或接近于其他方法的检出限与定量限，且本方法的分析时间较短.

很明显2台仪器的MRM采集模式所需的数据存储空间更小(表3、4)，且UPLC-QTOF上MRM模式更具节省存储空间的优势. 对比之下，MS和MSE模式占据的存储空间主要用于存储更多的样品质谱信息.

2.5 仪器的精密度

对3种不同质量浓度的FQs混标工作液重复测定6次，以考察仪器的精密度，测定浓度的重复性结果如表5所示. 结果表明：用UPLC-TQMS测定的相对标准偏差在1.2%～3.3%之间. 在UPLC-QTOF的MS/MSE/MRM模式下，测定的相对标准偏差分别为0.8%～3.8%、0.7%～11%和0.5%～6.7%，表明该检测方法有良好的重现性. 可以看出2台仪器的精密度良好.

表3 5种FQs在UPLC-TQMS的定量限、检出限、线性范围、相关系数和数据量Table 3 The limits of detection and quantification, linear range, correlation coefficient and data size for 5 FQs under UPLC-TQMS

表4 5种FQs在UPLC-QTOF不同采集模式下的定量限、检出限、线性范围、相关系数和数据量

表5 UPLC-QTOF和UPLC-TQMS下5种FQs质量极度检测结果的精密度Table 5 The precision of concentration detection for 5 FQs under UPLC-QTDF and UPLC-TQMS

2.6 环境样品分析

将实际环境样品于2台仪器各模式下进行检测，均只有OFX被检出，其他4种喹诺酮质量浓度低于检出限. 定量数据均由MassLynx4.1软件中的TargetLynx计算得到(表6). 2台仪器各模式下所测定的样品1与样品2的质量浓度呈现一致的大小规律，且平行测试之间偏差较小. UPLC-QTOF的MSE和UPLC-TQMS上测定的质量浓度无显著性差异，但是UPLC-QTOF的MRM模式和MS模式下检出的质量浓度高于UPLC-TQMS，可能是不同仪器和不同模式下的基质效应存在显著差异.

表6 UPLC-QTOF和UPLC-TQMS对氧氟沙星质量浓度的测定

3 结论

本研究采用超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱，建立了5种FQs的定量检测方法，各目标物在3种检测模式(MS/ MSE/ MRM)下的方法检出限在0.04～0.22 μg/L之间，相对标准偏差(RSD)在0.5%～11%之间. 通过与超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法比较发现，超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱具有与超高效液相色谱-质谱同样出色的定量能力和仪器精密度. 而高分辨飞行时间质谱还可对目标物准确定性，从而有效降低质谱MRM模式下假阳性的情况. 因此，本文为氟喹诺酮类抗生素的快速、准确定量分析提供了一种可靠的方法，具有较强的实用价值.