检测一氧化氮的荧光探针研究进展

吴志文，张振涛

(内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110)

一氧化氮(NO)是一种重要的气体分子，是通过三种不同的一氧化氮合酶(内皮型一氧化氮合酶eNOS；神经元一氧化氮合酶nNOS；诱导型一氧化氮合酶iNOS)将L-精氨酸转化为瓜氨酸而产生的[1]。从生理学上讲，NO是一种内源性的表皮舒张因子，可刺激血管平滑肌舒张，并且还充当神经递质和免疫系统中的抗感染分子，以抵抗感染。从病理上讲，NO与稳态障碍发作有关[2-4]。由于其明确的意义，开发用于实时追踪生物系统中NO水平的灵敏方法和工具，对于人类的健康至关重要。在过去的几十年中，电化学，电子顺磁共振，化学发光，比色法和荧光法等许多分析技术已被用于检测不同环境下的NO[5-11]。在这些方法中，基于荧光的生物成像方法因其出色的灵敏度和选择性，高分辨率，无创性，广泛的被用于NO的检测，目前，已经开发出用于检测NO的各种小分子荧光探针。特别是在过去的五年中，已经报道了各种具有改善的荧光性质和传感能力的NO荧光探针，其中一些在监测生物系统中的外源性和内源性NO方面显示出巨大的潜力。本综述总结了近年来报道的新型NO荧光探针。讨论了采用不同NO识别基团和方法的有机物和金属配合物荧光探针，以及它们在体外和体内实时定量检测外源性和内源性NO的应用。

通常，基于有机物的NO荧光探针通常包含两个关键元素，即NO识别位点和荧光团。NO识别位点可以与NO发生特异性化学反应，并激发荧光团发生特异性发性，起到捕捉NO的作用，很多官能团可以用作NO识别位点，例如邻苯二胺，可以与NO发生环化反应，生成苯并三唑；二氢吡啶(Hantzsch酯)，可以与NO发生氧化反应，将二氢吡啶芳构化；芳香族仲胺，可以与NO反应，生成N-亚硝产物。为了实现NO探针的细胞器靶向能力，还会配备一些官能团作为递送载体，以将探针特异性地运输到细胞器，如带正电荷的三苯基膦可以靶向到线粒体，带弱碱性吗啉可以靶向溶酶体。

1 基于有机物的NO荧光探针

1.1 基于邻苯二胺环化的荧光探针

由长野研究小组最早开发的基于邻苯二胺的NO荧光探针是生物系统中NO检测最广泛使用的探针[5,12-17]。在没有NO的情况下，将发生从富电子的邻苯二胺基团到荧光团的光致电子转移(PET)过程，以猝灭荧光。在富氧条件下与NO反应后，富电子的邻苯二胺部分可以转化为吸电子的苯并三唑环，从而阻断PET过程并激发荧光团，从而提供可检测的荧光发射。

2016年，Chen J B等[18]将邻二胺基苯基连接到了3,5-(2-羟基苯基)-二亚甲基吡咯上，首次合成了硼螯合荧光探针(BOPB)(图1)，该探针在622/643 nm的最大激发/发射波长下，可以敏感且选择性地响应，并且可以用于小鼠肝脏中的NO的检测。与之前报道的用于确定NO的荧光探针方法相比，该方法具有更长的检测波长(675 nm)，最短的衍生时间(12 min)和最低的LOD(0.02 nM)。

图1 BOPB探针对NO的传感机制

同年，Feng W等[19]合成了一种基于1,8-萘甲酰亚胺的邻苯二胺荧光探针LysoNONaph(图2)，用于对溶酶体中的NO进行成像。该探针在pH值为3.8～12的范围内不敏感，对NO的选择性高，灵敏度低，检出限低至4.57 mmol/L，因此可以用于细胞溶酶体成像。

图2 LysoNONaph探针对NO的传感机制

2018年，Zhang J等[20]通过将邻苯二氨基与BODIPY染料相连接，成功设计出了一种用于检测NO和亚硝酸盐的双响应式荧光探针1(图3)。该探针本质上由于PET效应而不会发荧光，但是在中性条件下用NO处理或在酸性环境中用亚硝酸盐处理时，探针会迅速变为高荧光状态，具有高选择性和低检测限。在细胞成像实验中，使用DEA·NONOate作为NO的源并在细胞内Cys和GSH的辅助下，探针1可以观察到蓝色荧光。

图3 探针1的合成及探针1对NO的预期传感机理

图4 探针2对NO的传感机制

同年，WangQ等[22]合成了一种选择性和灵敏的阳离子荧光探针(ROPD)(图5)，该探针以邻苯二胺基作为反应位点，以罗丹明作为荧光团。该探针在宽pH范围内在水相中显示出对NO的高选择性和灵敏度，并具有快速响应。同时，探针ROPD可以透过细胞膜，可用于实时观察L929和HeLa细胞中的外源NO，以及应激的RAW 264.7细胞中的内源性NO。

图5 ROPD探针对NO的传感机制

2019年，Jiang WL等[23]合成了dRB-OPD的荧光探针(图6)并用于识别NO。该探针以邻苯二胺基作为反应位点，以脱氧罗丹明B作为荧光团。dRB-OPD显示40秒钟内对NO的快速响应，荧光增强170倍。此外，该探针相对于脱氢抗坏血酸(DHA)，抗坏血酸(AA)和甲基乙二醛(MGO)表现出对NO的高选择性。特别地，该探针可以避免来自若丹明内酰胺基荧光NO探针(RB-OPD)中发现的半胱氨酸(Cys)的严重干扰。可以用于检测HepG2和RAW 264.7细胞中的外源性和内源性NO。

图6 dRB-OPD探针对NO的传感机制

1.2 基于芳族仲胺N-亚硝化的荧光探针

基于芳族仲胺N-亚硝化的荧光探针对NO的检测具有完美的选择性，因为由于仲胺基团的电子密度控制，与基于邻苯二胺类的荧光探针不同，该探针不受其他活性氧发生反应/氮物种(RNS/ROS)和活性羰基物质(RCS)物质的干扰。此外，芳族仲胺与各种金属离子的配位能力较低，这对于其高选择性也至关重要。

2017年，Mao Z等[24]设计了一种基于芳香族仲胺的N-亚硝化的新型荧光探针NCNO(图7)，探针NCNO可以在ROS，RNS和RCS之间以明显的选择性和灵敏度识别NO。由于其双光子激发和红光发射，可以检测到活细胞和深层组织中的NO。该探针还首次被用于监测缺血再灌注损伤(IRI)小鼠肾脏中的NO。

图7 NCNO探针对NO的传感机制

2019年Huo Y等[25]合成了一种芳香族仲胺N-亚硝化的探针1及可靶向线粒体的衍生物探针Mito1(图8)，作为荧光NO探针，该用于区分M1巨噬细胞和M2巨噬细胞的诱导型NO合酶(iNOS)水平差异。这两种探针具有独特的能力，能够同时响应NO的两种二次氧化物，即N2O3和ONOO3，因此，与大多数通常仅响应N2O3的现有荧光NO探针相比，反映细胞内的NO更加敏感和可靠。进一步表明该探针在癌症免疫疗法研究和相关的抗癌药物筛选中成像的应用潜力。

1906年《治安法官法》最终取消了治安法官的财产资格，仅规定任命的治安法官不得不住在本郡或居住在所担任治安法官的郡七英里内。1949年《治安法官法》扩大到离该郡15英里范围内居住，1979年《治安法官法》再一次规定直到今天仍是有关治安法官资格仅有的法令。现在治安法官的任命往往可虑下列情况：

图8 探针1和Mito1探针对NO的传感机制

1.3 基于二氢吡啶氧化的荧光探针

二氢吡啶(Hantzsch酯)可以被NO定量氧化，以平稳地提供相应的吡啶部分。因此，二氢吡啶基团可以用作NO捕获基团，用于开发新型荧光探针。更有趣的是，二氢吡啶与NO的反应可以在厌氧环境下进行，这将明显提高荧光探针对NO的选择性。

2016年，Ma S F等[26]合成了由7-甲氧基香豆素(作为荧光团)和二氢吡啶衍生物(作为NO的受体)组成DHP-1荧光探针(图9)，用于检测NO。探针DHP-1的光学特性和活细胞成像显示出对NO的快速响应，其荧光强度比背景增强了80倍，并且对NO的选择性高于其他活性氧或氮。DHP-1探针还可用于在生物学相关pH范围内检测活细胞中的NO。

图9 DHP-1 探针对NO的传感机制

同年，Wang H L等[27]合成了香豆素的水溶性二氢吡啶的衍生物DHPS(图10)，并将其成功应用于水溶液中的荧光传感一氧化氮(NO)。DHPS探针的荧光极弱，而加入NO溶液后其荧光极大地打开，并显示出高的选择性和对NO的敏感性。检测限为18 nM。细胞毒性试验证明DHPS和PYS都是生物相容的，DHPS已被成功应用于追踪RAW 264.7细胞中内源性产生的NO。

图10 DHPS探针的结构

2018年，Gao C等[28]通过将二氢吡啶和三苯基膦(TPP)部分引入到硼联吡啶(BODIPY)染料中，设计并合成了用于一氧化氮(NO)的线粒体靶向探针Mito-DHP(图11)。Mito-DHP通过在无氧条件下将二氢吡啶芳构化为荧光吡啶产物，可以有效地检测一氧化氮。Mito-DHP探针对多种活性氧/氮(ROS/ RNS)表现出对NO的高选择性，以及高灵敏度(25 nM的检测限)，pH稳定性和生物相容性。

图11 Mito-DHP探针对NO的传感机制

1.4 其他类型的有机基NO荧光探针

2014年，Xin Lv等[29]通过将特定的NO识别基团2-氨基-3-二甲基氨基联苯连接到Bodipy染料中，构建了荧光探针3(图12)，该探针该探针可以选择性地检测ROS/RNS和AA/DHA/MGO上的NO，检测限低至30 nM。将细胞用该探针预处理1小时并与DEA·NONONOate(50 mM)孵育1 h后，可以观察到细胞中强烈的荧光。这些结果证实了探针1具有可视化活细胞中NO水平的潜力。

图12 探针3对NO的传感机制

2019年Liu Y等[30]合成了基于花青染料(Cy7)的荧光探针(图13)，用于通过在Cy7染料的内消旋位置上连接甲基氨基来检测NO。由于分子内的电荷转移过程，该探针在800 nm处显示微弱的荧光发射，而用NO处理后，该探针迅速变成高度NIR荧光状态。检测限低至11.3 nM。该探针对NO的选择性超过活性氧，活性氮和金属离子。更重要的是，该探针对NO的荧光反应发生在生理上有利的NIR区域，从而使其能够进一步用于在背景干扰低且穿透深度较深的发炎小鼠模型中对内源性NO成像。

图13 Cy7-MA探针对NO的传感机制

同年，Fu YL等[31]开发了一种新型荧光探针8-HB(图14)，该探针以BODIPY作为荧光团，并以8-取代的肼为活性部位来检测NO。探针8-HB可以与NO/O2反应生成荧光脱水的BODIPY，并伴有少量的8-叠氮化物BODIPY。 8-HB具有出色的灵敏性(LOD=22 nM)。此外，8-HB具有很低的细胞毒性和良好的生物相容性，并能在活的HepG2细胞中选择性地检测NO活性氧/氮物种(ONOO-、H2O2和ClO-) 并检测活体RAW264.7细胞内源性NO。

图14 8-HB探针对NO的传感机制

2 基于金属配合物的荧光探针

2.1 基于铜(II)配合物的NO荧光探针

基于Cu(II)的配合物是开发NO荧光探针的理想选择。Cu(II)中不成对的电子与配体配位后，可以猝灭荧光团产生的荧光。但是用NO处理后，Cu(II)平稳地转化为Cu(I)，从而使淬灭作用消除，荧光恢复。

图15 Cu(II)探针对NO的传感机制

2017年，ALoas等[32]设计了两种新的基于Cu(II)的探针(图15)，用于一氧化氮的检测。传感器分别采用聚脯氨酸螺旋和哌嗪单元作为刚性间隔基，并通过FRET机制在7-羟基香豆素和荧光素生色团之间进行能量转移。这两种探针通过其对生理pH值下对NO的敏感，直接和选择性的比例响应，并使它们具有增强的细胞渗透性和亚细胞定位功能。

2.2 基于铱(III)配合物的NO荧光探针

稳定的铱(III)配合物由于其强而长寿命的荧光发射，也可以用作基于金属络合物的荧光团。可以引入一个NO识别基团来激发PET过程并猝灭荧光，从而提供另一种基于金属配合物的NO探针。

Wu C等[33]设计并合成了一种长寿命的发光铱(III)配合物探针1(图16)，用于监测从硝普钠(SNP)可控释放的NO。探针1在580 nm处存在SNP时显示15倍的开启发光。探针对SNP的线性响应在5～25 μM之间，检测极限为0.18 μM。重要的是，证明了HeLa细胞中NO的发光开关检测。

图16 铱(III)探针对NO的传感机制

3 结 语

近年来报道的用于在生物系统中对NO成像的各种荧光探针。大部分还是基于有机物的NO荧光探针，基于金属络合物的NO荧光探针很少，这些探针显示出高选择性和灵敏度，低细胞毒性和深层的组织穿透能力，非常适合在体外和体内对NO成像。但是，同样也存在浓度低，半衰期短和扩散特性快等缺点，因此开发出能够准确分析生物系统中NO的荧光探针仍然是科学家面临的巨大挑战。