加工方式对发酵面团中小麦醇溶蛋白抗原性的影响

王 娜，孟利军，黄忠民，艾志录，李 娜，张改平

（1 农业农村部动物免疫学重点实验室 郑州450002 2 河南农业大学食品科学技术学院 郑州450002 3 河南农业大学动物医学院 郑州450002 4 农业农村部大宗粮食加工重点实验室 郑州450002 5 郑州市营养与健康食品实验室 郑州450002）

近几十年来，食物过敏引起全世界广泛的关注，被视为一种严重的公共营养卫生问题。小麦作为FAO 公认的常见八大过敏原之一，危害着小麦过敏人群的健康。小麦过敏多属于迟发性过敏反应，有较高的病患率和漏诊率，并发症状较多。它主要影响皮肤、内脏、呼吸道的健康，引起运动激发过敏症、职业哮喘、鼻炎、接触性荨麻症、乳糜泻肠炎、麻风皮肤病等[1]，还与反复发作的过敏性休克相关[2]。Jiang 等[3]回顾中国人群1 952 次严重过敏反应，发现食物（77%）是常见严重过敏反应的主要诱因，其中小麦（37%）也是诱发中国人群过敏性休克最常见食物。日本研究同样显示：小麦是食物依赖运动诱发过敏性休克主要的致敏食物[4]。不同的小麦过敏原对过敏患者有着不同的致病机制，并呈现不同的临床症状。小麦过敏的途径很多，包括吸入、摄入，也有接触小麦产品而导致过敏的报道。

小麦醇溶蛋白是小麦主要过敏原之一，根据电泳图谱上相对迁移率不同，主要分为α-、β-、γ-、ω-型4 种。α-、β-、γ-醇溶蛋白分子质量为31～45 ku，ω-醇溶蛋白分子质量45～75 ku。Biagi等[5]认为醇溶蛋白是引起乳糜泻的主要蛋白。γ-醇溶蛋白也被推测是乳糜泻的一个重要过敏原[6]。Rasanen 等[7]对18 个小麦口头激发过敏的儿童研究发现，超过半数的儿童产生了能与醇溶蛋白特异性结合的IgE。Morita 等[8]和Palosuo 等[9]研究表明γ-醇溶蛋白和ω5-醇溶蛋白是引发小麦依赖运动激发性过敏症的主要过敏原。

麸质是目前唯一规定了食品中含量阈值的过敏原成分，含量不高于20 mg/kg，称为“无麸质食品”[10]。我国对小麦过敏的研究几乎空白，在国际贸易中涉及的小麦过敏问题给我国面制品的生产发展带来严峻的挑战。例如我国出口啤酒曾多次由于未能符合欧盟关于食品中麸质过敏原成分标识的标准而被拒。

发酵面制品是几乎半数中国人口的主要营养源，是中国旱作农业、小麦产业发展的基础，与人们的日常饮食密切相关。随着科学技术的发展，食品加工方式呈多样化，如微波、超高压、速冻技术等在食品领域得到较广泛的应用。因此，研究食品加工对发酵面团中小麦醇溶蛋白致敏性的影响具有重要意义。本文研究不同加工方式对发酵面团中小麦醇溶蛋白抗原性的影响，为探讨加工方式在脱敏食品生产中的作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

郑麦7698，购于河南省农业科学院；60Co 辐照源，河南省科学院同位素有限公司；BCA 蛋白定量检测试剂盒，北京鼎国昌盛有限公司；彩虹预染Marker（11～180 ku），北京索莱宝科技有限公司；夹心式酶联免疫小麦醇溶蛋白ELISA 试剂盒（一抗是兔源抗小麦醇溶蛋白抗体；标记抗体是HRP 标记的羊源抗兔和植物的醇溶蛋白抗体），江苏绿叶生物有限公司；其它试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

MLU-202 布勒实验磨粉机，中国无锡布勒机械公司；非标定制螺旋速冻装置，郑州亨利制冷设备有限公司；GCSJ-15-1-7 臭氧水机，武汉威蒙环保科技有限公司；WD900B 型微波炉，顺德市格兰仕电器实业有限公司；KQ-500DE 超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；FPG5620YHL 超高压处理装置，英国SFP 公司；SX-500 高压蒸汽灭菌锅，Tomy 公司；ZW-SY-2D 脉冲强光杀菌设备，宁波中物光电杀菌技术有限公司；LGJ-10D 真空冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；Mini-PROTEAN165-8003 电泳仪，Bio-Rad 公司；CHEMI SYSTEM 凝胶成像及分析系统，UVP 公司；M5酶标仪，Molecular Devices 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 不同加工处理发酵面团 选取小麦品种为郑麦7698，润麦，磨粉，制作成发酵面团[11]，轧成1.4～1.5 mm 厚的面皮，分别进行以下处理，如表1所示。

表1 发酵面团的不同加工处理Table 1 Different processing of fermented dough

空白发酵面团作为阳性对照组CK，每个处理设3 个重复，所有处理后的样品均立即冷冻干燥，打磨成粉，4 ℃备用。

1.3.2 样品中小麦醇溶蛋白的提取 参考潘治利[18]的方法从样品中提取小麦醇溶蛋白，用0.45 μm 尼龙66 滤头过滤，并用BCA 法测定蛋白浓度。

1.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子质量 参照蛋白质电泳技术[19]，小麦醇溶蛋白与5×上样缓冲液按1∶1 混合，煮沸10 min 后上样。

1.3.4 夹心法ELISA 测定蛋白的抗原性 具体方法参考文献[20]：

本研究用致敏性残存率评估致敏蛋白抗原性的变化。

样品抗原与一抗混合→温育→洗涤→加入酶标抗体→温育→洗涤→显色→浓硫酸终止反应→酶标仪读数。

按照公式计算发酵面团中过敏原小麦醇溶蛋白的致敏性残存率：

式中：OD空白为70%乙醇的吸光值；OD对照为阳性对照发酵面团的吸光值；OD样品为样品的吸光值。每个处理重复测3 次。

1.3.5 数据处理 数据分析采用Excel 2007 和SPSS.16.0 软件，各组数据采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05 表示具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 热加工和冷处理对小麦醇溶蛋白抗原性的影响

2.1.1 小麦醇溶蛋白的SDS-PAGE 电泳结果分析 由图1可知，CK 中小麦醇溶蛋白目的条带清晰，亚基分明，说明本试验采用的提纯小麦醇溶蛋白试验方法可行。与CK 相比，热加工和冷处理后发酵面团中小麦醇溶蛋白的特征谱带发生了变化，其中热蒸和高温高压处理后目的蛋白变化尤为显著。二者共同之处是在55 ku 左右生成新的条带。二者均属于湿热处理，可能是因为湿热处理导致小麦醇溶蛋白发生聚合或交联形成大分子蛋白质。不同之处是高温高压处理后，小麦醇溶蛋白35 ku 左右的特征谱带明显淡化至几乎消失，说明其α-、β-、γ-醇溶蛋白的含量明显降低，高压强化了小麦醇溶蛋白的聚合或交联作用。热蒸处理后小麦醇溶蛋白35 ku 左右的主要谱带稍微淡化，而25 ku 左右的谱带明显加深。可能是因为热蒸处理使部分小麦醇溶蛋白发生了降解，生成了更多小分子蛋白。

图1 热加工和冷处理发酵面团中小麦醇溶蛋白的SDS-PAGE 电泳图Fig.1 SDS-PAGE of wheat gliadin in fermented dough under thermal processing and cold treatments

2.1.2 小麦醇溶蛋白的ELISA 结果分析 由图2可知，烘烤处理和冷处理对发酵面团中小麦醇溶蛋白的抗原性影响均不显著（P>0.05），而热蒸、微波和高温高压处理样品中小麦醇溶蛋白的抗体结合能力均显著低于对照（P<0.01）。热蒸处理其抗原性降低了35.37%；微波处理和高温高压处理其抗原性分别降低了62.63%和61.47%。

结合图1可知，热蒸处理和高温高压处理后小麦醇溶蛋白抗体结合能力显著低于对照，主要归因于小麦醇溶蛋白一级结构的改变。高温高压处理后样品中α-、β-、γ-亚基含量大大减少，同时其致敏蛋白的消化稳定性降低[21]，均为其致敏性的下降提供了可能。高温高压降低致敏蛋白的免疫反应性的研究不仅仅局限于小麦，在花生、绿豌豆和羽扇豆、榛子粉的相关研究中也得到类似结果[22-26]。微波处理后，发酵面团中小麦醇溶蛋白的一级结构没有发生明显改变，可能是进行热处理使蛋白发生构象和化学变化[13]，从而影响其发生免疫反应，最终降低了小麦醇溶蛋白的致敏性。

图2 热加工和冷处理发酵面团中小麦醇溶蛋白抗原性的变化Fig.2 Changes in antigenicity of wheat gliadin in fermented dough under thermal processing and cold treatments

2.2 非热加工对小麦醇溶蛋白抗原性的影响

2.2.1 小麦醇溶蛋白的SDS-PAGE 电泳结果分析由图3可以看出，与CK 相比，臭氧熏蒸、脉冲强光和超声波处理后小麦醇溶蛋白的特征谱带并未发生显著变化，说明发酵面团中小麦醇溶蛋白分子质量未发生明显变化。

2.2.2 小麦醇溶蛋白的ELISA 结果分析 由图4可知，臭氧熏蒸60 min，脉冲强光处理（PL）和超声波处理均能显著降低发酵面团中小麦醇溶蛋白的抗原性（P<0.01），其抗原性均降低到70%以下，尤其是臭氧熏蒸60 min 时，其抗原性降到最低，降至51.02%，降低了48.98%。

图3 非热加工处理发酵面团中小麦醇溶蛋白的SDS-PAGE 电泳图Fig.3 SDS-PAGE of wheat gliadin in fermented dough under non-thermal processing treatments

2.3 超高压处理对小麦醇溶蛋白抗原性的影响

2.3.1 小麦醇溶蛋白的SDS-PAGE 电泳结果分析 由图5可知，超高压处理后，小麦醇溶蛋白无论从条带数量、位置和灰度均没有明显差异，表明单纯的压力（300 MPa 以内）处理对发酵面团中小麦醇溶蛋白分子质量没有影响。

2.3.2 小麦醇溶蛋白的ELISA 结果分析 如图6所示，超高压处理后发酵面团中小麦醇溶蛋白的抗原性呈波动型变化，先升高后降低。与CK 相比，100 MPa 时，小麦醇溶蛋白的抗原性变化最显著 （P<0.05），增加了约61.8%；150 MPa 和200 MPa 时其抗原性变化不显著（P>0.05），略有下降，

臭氧作为一种强氧化剂，能够对蛋白质进行氧化，破坏或影响蛋白质的表位，从而达到降低过敏原的效果，并且臭氧熏蒸时间越长，其抗原性降低越多。脉冲强光处理过程中过敏原变化可能与其光热、光物理和光化学效应有关，但其确切机制尚不清楚。脉冲强光处理随着时间的延长，其抗原性变化不大。Zhao 等[27]研究发现PL 脉冲光能够将整个花生核内的所有主要变应原减至无法检测到的水平。超声处理可能是通过改变小麦醇溶蛋白的二、三级结构，而引起其致敏性的变化。Kasera等[28]、Gulseren 等[29]的研究结果都表明超声会影响蛋白质空间结构的改变。但仍增加了22%左右；250 MPa 时，其抗原性降至最低，降低了4%；300 MPa 时，其抗原性又略显增加，增加到120%左右。

图4 非热处理发酵面团中小麦醇溶蛋白抗原性的变化Fig.4 Changes in antigenicity of wheat gliadin in fermented dough under non-thermal processing treatments

100 MPa 时，超高压诱导小麦醇溶蛋白的高级结构发生变化[30]，导致过敏原的表位暴露出来，所以抗原性增强。150，200，250 MPa 时，小麦醇溶蛋白的致敏性残存率变化不显著（P>0.05），可能是由于过大的压力使蛋白质的结构再一次发生变化，导致其构象表位被改变或破坏，不能被IgG 抗体识别[31-32]，从而不能诱发免疫反应，最终降低了其抗原性。300 MPa 时，随着压力的增加，蛋白质又会重新发生聚合，抗原性增加。

图5 高静压处理发酵面团中小麦醇溶蛋白的SDS-PAGE 电泳图Fig.5 SDS-PAGE of wheat gliadin in fermented dough under high static pressure treatments

2.4 辐照处理对小麦醇溶蛋白抗原性的影响

2.4.1 小麦醇溶蛋白的SDS-PAGE 电泳结果分析 由图7可知，不同60Co 辐照剂量处理前后，发酵面团中小麦醇溶蛋白的特征谱带没有发生显著变化，说明1～15 kGy 的辐照剂量对发酵面团中小麦醇溶蛋白的分子质量无影响，小麦醇溶蛋白对辐照的稳定性较强。

2.4.2 小麦醇溶蛋白的ELISA 结果分析 由图8可知，辐照处理后发酵面团中小麦醇溶蛋白的抗原性呈波动型变化，先降低后升高。与CK 相比，辐照剂量为1，3，5，7 kGy 时，发酵面团中小麦醇溶蛋白的抗原性变化不显著 （P>0.05），但是1 kGy 时，致敏性增加了约20%；3，5 kGy 剂量时，其致敏性几乎保持不变；7 kGy 时，抗原性降低了约20%左右；辐照剂量为10 kGy 时，其致敏性变化极显著（P<0.01），降低了29.92%。13，15 kGy 时，样品中小麦醇溶蛋白的抗原性呈增加趋势，15 kGy 时，抗原性增加了约20%。结合图7可知，辐照改变发酵面团中小麦醇溶蛋白的抗原性可能是因为辐照导致目的蛋白质二级和三级结构发生变化，引起了大量的蛋白质变性[33]。

图7 不同60Co 辐照剂量处理下发酵面团中小麦醇溶蛋白的SDS-PAGE 电泳图Fig.7 SDS-PAGE of wheat gliadin in fermented dough under different 60Co irradiation doses

图8 不同辐照剂量处理发酵面团中小麦醇溶蛋白抗原性的变化Fig.8 Changes of antigenicity of wheat gliadin in fermented dough under different irradiation doses

2.5 加工对小麦醇溶蛋白增敏效果的比较

由图9可以看出，100 MPa 时，发酵面团中小麦醇溶蛋白抗原性增加极显著（P<0.01），增加了61.84%。辐照剂量为1，15 kGy 时和150，200，300 MPa 超高压处理时，发酵面团中小麦醇溶蛋白抗原性增加不显著（P>0.05），增加了约20%左右。由此可知，保压温度35 ℃，保压时间20 min 时，300 MPa 以内的静态超高压处理不合适用于发酵面团的加工，更高压力对发酵面团中小麦醇溶蛋白的抗原性影响仍需进一步研究。

2.6 加工对小麦醇溶蛋白脱敏效果的比较

由图10可以看出，热蒸、微波、高温高压、60Co 7 kGy、60Co 10 kGy、臭氧熏蒸60 min、脉冲强光和超声波处理均能显著降低发酵面团中小麦醇溶蛋白的抗原性（P<0.05），其抗原性均降至80%以下，其中微波和高温高压处理的脱敏效果最好，分别降至37.36%和38.52%。结合图1可知，从蛋白摄入方面考虑，微波处理比高温高压更适合用于发酵面制品，这一新型加热方式更值得推广。从脱敏效果来看，与烘烤处理相比，热蒸处理更适合发酵面团的加工，也印证了中国传统饮食中蒸馒头、包子的合理性。由此推测也可能是这一中国劳动人民的智慧结晶大大降低了中国人群发生小麦过敏的概率。这一发现与水煮处理降低非发酵面团小麦醇溶蛋白的致敏性不谋而合[34]，无一不体现中国饮食文化的博大精深。随着时代的发展，食品加工方式的多样化，新型加工方式，如臭氧熏蒸、脉冲强光和超声波等均可用于发酵面制品加工中，辐照在发酵面制品加工中运用时要注意剂量的控制。

图9 发酵面团中小麦醇溶蛋白增敏加工方式Fig.9 Processing methods for increasing allergenicity of wheat gliadin in fermented dough

图10 发酵面团中小麦醇溶蛋白脱敏加工方式Fig.10 Processing methods for reducing sensitization of wheat gliadin in fermented dough

3 结论

综合以上分析，不同加工方式对发酵面团中小麦醇溶蛋白的抗原性影响不同，而相同加工方式的不同条件对发酵面团中小麦醇溶蛋白的抗原性影响也有显著差异。300 MPa 以内的静态超高压处理具有增敏作用，不适合用于发酵面团。热蒸、微波、高温高压、60Co（7，10 kGy）、臭氧熏蒸（60 min）、脉冲强光和超声波处理均能显著降低发酵面团中小麦醇溶蛋白的抗原性，均可用于发酵面制品加工中，其中微波、高温高压和热蒸处理在发酵面制品加工中更值得推崇。加工可以作为食品过敏安全控制的有效手段。