一种高效检测水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法

穆小婷 韩文节 欧志鹏 华四妹 陈智标 谢卫兵 廖侦成

1（清远市农产品质量检验检测中心，广东清远 511500）

2（清远市农业科技推广服务中心，广东清远 511500）

孔雀石绿和结晶紫属于人工合成的三苯甲烷类碱性工业染料，主要用来预防和治疗各类水产动物的水霉病、锶霉病、寄生虫病、小瓜虫病、指环虫病、斜管虫病、三代虫病及其他一些细菌性疾病等，也可用于水产品的输入和水产品暂养等过程，以延长水产品特别是鱼类产品的存活时间。孔雀石绿和结晶紫被鱼类吸收后，会代谢还原为脂溶性的隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，在鱼类的脂肪组织中稳定残留，其化学官能团“三苯甲烷”被证明具有高毒、高残留、致癌、致畸、致突变等毒副作用，危害食用者身体健康，同时含有孔雀石绿和结晶紫的废水排放会污染水环境。目前针对孔雀石绿和结晶紫残留量检测方法主要有高效液相色谱法、液质联用法及一些速测技术，国内常用标准主要有GB/T 19857—2005、GB/T 20361—2006、SC/T 3021—2004 等，但均存在前处理复杂繁琐、所用试剂及前处理仪器多等缺点。本方法前处理只用一种提取剂，提取步骤相对简单，且所用试剂使用种类和数量少，大大减少了对环境的污染。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

乙腈，液相色谱纯，德国默克公司；甲酸，优级纯，美国ACS 恩科化学；乙酸铵，分析纯，西陇科学股份有限公司；甲醇，液相色谱纯，德国默克公司；孔雀石绿草酸盐溶液，100 μg/mL，农业部环境保护科研监测所；隐色孔雀石绿溶液，100 μg/mL，农业部环境保护科研监测所；结晶紫溶液，100 μg/mL，农业部环境保护科研监测所；隐色结晶紫溶液，100 μg/mL，农业部环境保护科研监测所；孔雀石绿-D5，50 μg/mL，农业部环境保护科研监测所；隐色孔雀石绿-D6，50 μg/mL，农业部环境保护科研监测所；微孔滤膜，0.22 μm，安捷伦公司；中性氧化铝小柱，1 g/6mL，Waters 公司。

电子天平，120 g/0.1mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；漩涡混合器，上海精科实业有限公司；高速离心机，北京医用离心机厂；超纯水机，德国默克公司；KQ-600E 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；固相萃取装置，上海熙扬仪器有限公司。

1.2 前处理方法

准确称取5.00 g 待检水产品于50 mL 离心管中，加1.0 μg/mL的孔雀石绿-D5 和隐色孔雀石绿-D6 混合标准溶液50 μL 作为内标，旋涡混合30 s，加10 mL 乙腈提取，旋涡振荡1 min，超声（频率：40 KHz）提取10 min，4 000 r/min 离心5 min，将上清液移入15 mL 离心管备用；将中性氧化铝小柱安装在固相萃取柱上，用5 mL 乙腈活化，取离心后的上清液5 mL 到已活化好的中性氧化铝柱，收集流出液，过孔径0.22 μm 滤膜于10 mL 的干净离心管中，分别取0.5 mL 滤液和0.5 mL 超纯水到上机瓶，摇匀，供高效液相色谱质谱联用仪测定。同时做空白试验，空白试样中不含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的空白水产品样品。

2 结果与分析

2.1 提取剂和净化柱的选择

目前检测水产品中残留的孔雀石绿、结晶紫时，常使用的提取剂包括乙酸铵缓冲液、乙腈、甲醇、二氯甲烷等，辅助提取剂对甲苯磺酸、盐酸羟胺等，而乙腈被公认为是提取孔雀石绿的最佳溶剂。张艺蓓等研究发现，隐色孔雀石绿在乙腈中的溶解度要高于甲醇，且根据试验可知，若提取时加入缓冲盐或离子对试剂等，需用二氯甲烷溶液进行萃取净化，因水与二氯甲烷属于共轭溶液，较难或需较长时间离心才能分层。本研究综合考虑后选择乙腈作为提取剂，一方面可提高对目标物的提取效率，同时减少溶液因多次转移造成损失。目前常见的净化柱包括氧化铝柱、PRS 柱、HLB 柱、C18柱、MCX 柱等，因酸性氧化铝柱经过乙腈活化后对脂肪的吸附能力变弱，而碱性氧化铝柱对孔雀石绿有吸附作用而易导致目标物的损失，所以实验优先选用中性氧化铝小柱。左舜宇等通过对中性氧化铝柱、HLB 柱、C18柱、MCX 柱净化效果比对试验发现，中性氧化铝小柱净化效果最好。本试验最终采用中性氧化铝柱进行待测物的净化。

下页 图1～图6 为待测物及内标物的定性定量离子色谱图。

2.2 标准曲线及检出限试验

本试验以罗氏虾为测定样品，选0 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、40.0 μg/kg、100.0 μg/kg 9 个点做标准曲线，检测结果显示，孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV）标准曲线分别为y=1.039x -0.871、y=1.002x -0.051、y=1.015x-0.343、y=0.981x+0.410，相关系数r 分别为0.998 5、0.999 5、0.999 5、0.999 5，均满足国家标准《GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范食品理化检测》中附录F（检测方法确认的技术要求）相关系数不低于0.98 的要求。

孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫4 种检测指标在GB/T 19857—2005 液相色谱串联质谱法中检出限均为0.5 μg/kg，在GB/T 19857—2005 高效液相色谱法中检出限均为2.0 μg/kg，在GB/T 20361—2006 高效液相色谱荧光检测法中均为0.50 μg/kg，本试验根据3 倍信噪比来计算检出限，由结果可知，4 种检测指标检出限均可达到0.5 μg/kg。

图1 孔雀石绿定性定量离子色谱图

图2 隐色孔雀石绿定性定量离子色谱图

图3 结晶紫定性定量离子色谱图

图4 隐色结晶紫定性定量离子色谱图

图5 孔雀石绿-D5离子色谱图

图6 隐色孔雀石绿-D6离子色谱图

2.3 加标回收率及精密度试验

试验以国家标准GB/T 19857—2005 中方法测定低限为基础，国家标准GB/T 27404—2008 附录F 中检测方法确认的技术要求为试验依据，选取有代表性的草鱼和罗氏虾为测定样品，在方法测定低限（0.5 μg/kg）、2 倍方法测定低限（1.0 μg/kg）、10倍方法测定低限（5.0 μg/kg）进行三水平试验，结果分别见表1、表2。

表1 草鱼中4 种待测物回收率及精密度

表2 罗氏虾中4 种待测物回收率及精密度

由表1、表2 结果可知，方法回收率在87.30%～119.20%之间，可达到国家标准要求。

本试验提取过程只需一种提取剂，净化后过孔径0.22 μm 微孔滤膜后即可上机，不需要进行氮气浓缩处理，大大简化了样品前处理步骤，结果表明，该方法标准曲线、检出低限、回收率、精密度等各检测技术指标同时可满足国家标准GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中附录F（检测方法确认的技术要求）要求。

3 结论

试验结果表明，本方法简单快速，适用于水产品中孔雀石绿和结晶紫的大批量检测，具体优势包括以下几个方面：方法前处理提取过程需一种提取剂乙腈，极大地简化了提取过程，同时减少了溶液因多次转移造成的损失；方法前处理净化过程只需过柱后再过0.22 μm 微孔滤膜即可上机检测，检出限和回收率等相关参数均可达到国家相关标准要求，不需再进行浓缩净化，既简化了步骤，又省去了试剂和氮吹等复杂仪器的使用；方法中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫4 种检测指标可一同进行分析检测；方法采用曲线和样品一同进行前处理的内标法进行校正，保证曲线和样品始终在同一条件下进行处理，有效降低了前处理操作过程中的操作误差和其他条件导致的不统一性及基质效应对结果的影响。