视黄酸相关孤儿受体-白介素-23信号通路诱导病理性Th17细胞分化介导血压升高机制研究

王 敏，吴春立，魏芳晶，于赛华，阴淑莹，李爱英，任保军

(内蒙古医科大学附属医院心血管内科，内蒙古 呼和浩特 010010)

原发性高血压是以体循环动脉压升高为主要临床表现的心血管综合征，是重要的心脑血管病危险因素，可损伤重要器官如心、肾、脑的结构和功能，最终导致这些器官功能衰竭，探索高血压发病机制并积极开展有效防治刻不容缓。人们对于高血压病的发病机制进行了大量的研究，表明多种因素参与了高血压病的发病机制，包括遗传环境、解剖、适应性、神经系统、内分泌体液因子以及血流动力学。盐敏感性是连接盐与高血压的遗传基础，是原发性高血压的一种中间遗传表型。不同的患者对盐的敏感性存在差异，分为盐敏感性和非盐敏感性患者，前者患高血压的几率相对较大，约为50%～60%[1-2]。与血压盐敏感性相关联的高血压称为盐敏感性高血压 (Saltisensitive hypertension，SSHT)。研究表明，盐敏感人群的高血压发病率和病死率均高于盐抵抗性人群[3-4]，但发病机制不明。

既往研究证实内皮功能障碍、肾素-血管紧张素-醛固酮系统异常、交感神经系统激活、离子转运异常等参与SSHT的发生和发展。同时高血压是一种慢性炎症综合征，免疫异常参与其中，其中尤以病理性辅助性T 细胞17(T helper cell 17,Th17)明显。Th17分泌白介素-17A(Interleukin-17，IL-17A)可引起血管内皮功能异常，诱发内源性一氧化氮(NO)减少至血管收缩，同时产生炎症损伤导致血管重构，血管硬化、血压升高[5]。白介素-23(Interleukin-23，IL-23)是促使Th17分泌IL-17及维持病理形态的重要细胞因子，它通过上调IL-23受体(IL-23R)并与之结合产生以上效应。视黄酸相关的孤儿受体(RORγt)是Th17细胞发育所必需的，RORγt在IL-23R的产生过程中发挥着重要的作用，RORγt缺陷可致Th17分化过程中IL-23R明显减少，因此高盐可能通过以上位点在高血压发病中发挥作用。本项目将从高盐导致病理性Th17细胞分化这一全新的视角，首次探讨RORγt-IL-23R信号通路在SSHT发病中的作用，探讨SSHT发病的免疫机制，为高血压的防治提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年6月至2019年6月在内蒙古医科大学附属医院心内科病区住院的高血压患者，经患者同意后，予盐负荷试验，通过此试验筛选SSHT患者，及非盐敏感性高血压患者各30例，正常血压人群健康志愿者30例为对照组，抽取外周静脉血。其中，男52 例，女38例；年龄43～71岁，平均(57.63±9.24)岁。依据高血压分级标准分为：高血压Ⅰ级43 例，高血压Ⅱ级27 例和高血压Ⅲ级21 例。高血压组和健康对照组性别、年龄等资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。病例纳入标准：符合原发性高血压诊断标准。排除标准：不同意参加实验研究者，合并严重疾病者。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象都签订了知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 Th17细胞分化机制：①样本收集与分组：选择内蒙古医科大学附属医院心内科病区住院的高血压患者，经患者同意后，予盐负荷试验，通过此试验筛选SSHT患者，选取SSHT及非盐敏感性高血压患者各30例，正常血压人群健康志愿者30例，抽取外周静脉血。②检测正常血压人群健康志愿者、盐敏感性高血压患者及非盐敏感性高血压患者外周血CD4+T细胞中Th17细胞比例：将各组外周静脉血高速冷冻离心机梯度离心，分离外周单个核细胞，使用抗IgG磁珠阴性分选单个核细胞中总CD4+T细胞，釆用流式细胞技术检测CD4+IL-17A细胞比例。 ③检测正常血压人群健康志愿者、SSHT患者及非盐敏感性髙血压患者外周血IL-17A：将各组外周血离心后取上层血清，ELISA检测IL-17A。

1.2.2 RORγt-IL-23R信号通路：①检测正常环境、不同浓度NaCl(10、20、40、80 mmol/L)下人初始CD4+T细胞中Th17细胞比例：分离正常血压健康志愿者外周血总CD4+T细胞(方法如前述)，釆用流式活化细胞分选仪，分选初始CD4+T细胞(CD45RA、CD45RO、CD25、CD127)体外培养，此后分别加入不同浓度NaCl(0、10、20、40、80 mmol/L)， 4 h后釆用流式细胞技术检测各组CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例。②检测正常环境、不同浓度NaCl(10、20、40、80 mmol/L)下外周血IL-17A：将各组外周血离心后取上层血清，ELISA检测IL-17A。③40 mmol/L NaCl下CD4+T细胞分别加入RORγt拮抗剂、IL-23R拮抗剂，观察对Th17细胞分化影响，检测P38-RORγt-IL-23R信号通路：40 mmol/L NaCl下CD4+T细胞加入RORγt拮抗剂，检测IL-17A表达变化，流式细胞技术检测Th17细胞比例； 40 mmol/L NaCl下CD4+T细胞加入IL-23R拮抗剂，检测IL-17A表达变化，流式细胞技术检测Th17细胞比例。

2 结 果

2.1 各组CD4+Th17细胞占CD4+T细胞比例 与对照组相比盐敏感性高血压组CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例明显增高，具有统计学意义，与对照组相比非盐敏感性高血压组CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 CD4+Th17细胞占CD4+T细胞比例

2.2 各组外周血CD4+Th17细胞占IL-17A细胞比例 与对照组相比盐敏感性高血压组的IL-17A比例差异无统计学意义(P>0.05)，与对照组相比非盐敏感性高血压组的IL-17A 比例差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组外周血CD4+Th17细胞占IL-17A细胞比例(%)

2.3 不同浓度NaCl干预下各组 CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例 不同浓度NaCl培养人初始CD4+T细胞，CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例均增高，并且随着NaCl浓度增高， CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例逐渐增高。见图2。

图2 不同浓度NaCl干预下各组 CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例

2.4 不同浓度NaCl干预下CD4+Th17细胞/CD4+T细胞 不同浓度NaCl培养人初始CD4+T细胞中IL-17A水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。并随着培养基NaCl浓度的增高，CD4+T细胞中IL-17A水平逐渐增高。见表2。

表2 不同浓度NaCl干预下CD4+Th17细胞/CD4+T细胞(%)

2.5 40 mmol/LNaCl下CD4+T细胞分别加入RORγt拮抗剂、IL-23R拮抗剂CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例 40 mmol/L NaCl培养人初始CD4+T细胞组做对照组，与对照组相比加入RORγt拮抗剂CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例减少，与对照组相比加入IL-23R拮抗剂CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例减少。见图3。

图3 加入RORγt拮抗剂、IL-23R拮抗剂CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例

3 讨 论

2017中国心血管病报告，中国心血管患者仍然持续增加，心血管病现患人数2.9亿。随着我国人民生活水平的提高和人口老龄化，冠心病、高血压疾病患病率明显增加[6]。 以高血压为危险因素诱发的心脑血管疾病目前持续上升趋势，进行高血压有效防治意义重大，探索其发病机制刻不容缓。盐敏感性是盐与高血压的链接基础，但机制不明。SSHT[7-9]的特征在于响应于膳食盐摄入增加的血压升高，并且与心血管和肾脏疾病的风险增加相关。其与种族、地理环境、社会因素、肾脏功能、激素和饮食习惯等相关。近年来的研究发现高盐可使初始CD4+细胞向病理性的TH17细胞分化[10-11]。近年来的研究表明，高血压伴有局部和系统性的炎症反应，与免疫炎症相关的淋巴细胞及其细胞因子参与了高血压的发生与发展[12-14]。研究表明，抑制高血压 T 淋巴细胞参与的炎症反应，就能够减轻血压升高及其导致的靶器官损害[15]。

Th17细胞属CD4+效应T细胞亚群,参与介导炎性反应、自身免疫性疾病的发生和发展。分化成熟的Th17分泌IL-17,在多种自身免疫性疾病和炎性疾病中起关键作用[16]。TH17在高血压的发病中起着重要作用，TH17分泌IL-17A可引起血管内皮功能障碍，导致内源性NO减少血管收缩，同时炎症损伤导致血管重构，血管硬化、血压升高[17-18]。实验结果显示盐敏感性高血压组CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例明显高于健康志愿者组。不同浓度NaCl培养人初始CD4+T细胞，CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例均高于健康志愿者组，并且随着NaCl浓度增高， CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例逐渐增高。表明SSHT患者外周血TH17细胞比例及IL-17升高，并与盐浓度显正相关。说明TH17细胞引起的免疫反应参与了高血压的进程，促进SSHT的发生。

IL-23 是一种新的免疫调节因子，研究证明IL-23在一些自身免疫性疾病中存在前炎性反应活性[5]。IL-23是促使Th17分泌IL-17及维持病理形态的重要细胞因子，它通过上调IL-23受体(IL-23R)并与之结合产生以上效应。视黄酸相关的孤儿受体(RORγt)是Th17细胞发育所必需的，也在IL-23R的产生过程中发挥着重要的作用，RORγt缺陷可致Th17分化过程中IL-23R明显减少。 本研究结果显示高浓度NaCl培养基下CD4+T细胞中分别加入RORγt拮抗剂、IL-23R拮抗剂CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例均较40 mmol/L NaCl培养人初始CD4+T细胞组CD4+Th17细胞占CD4+T细胞的比例降低，说明RORγt-IL-23R信号通路可诱导病理性Th17细胞分化从而导致SSHT的发生。

综上所述，TH17细胞引起的免疫反应参与了高血压的进程，促进SSHT的发生。RORγt-IL-23R信号通路可诱导病理性Th17细胞分化从而导致SSHT的发生。