原纤维蛋白1在胃癌组织中的表达及与预后的关系

郭 栋，魏 鹏，梁 刚，杨学超

(陕西核工业二一五医院,陕西 咸阳 712000)

胃癌(Gastric cancer,GC)是胃肠道最常见的恶性肿瘤之一，我国胃癌每年的新确诊人数约占世界范围的40%以上，严重损害患者的身心健康[1]。近年来，虽然关于胃癌发生、发展的分子机制研究已经获得了重大进展，但是与胃癌患者预后相关的分子标志物仍需进一步研究[2-3]。原纤维蛋白-1(Fibrillin-1，FBN1)是构成细胞外基质微纤维的主要成分，其主要作用是保持结缔组织的形态完整和功能正常[4]。据报道，卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、甲状腺癌样本中FBN1基因的表达量和拷贝数均明显增多，且与患者预后密切相关[5-8]。本研究通过测定FBN1在胃癌及其配对癌旁组织中的表达水平及与患者预后的相关性，探讨其在胃癌发生、发展过程中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年1月至2013年12月期间行胃癌根治术患者的石蜡包埋标本100例，其中男54例，女46例；年龄38～76岁，平均(55.85±11.80)岁；中高分化44例，低分化56例；T1-T2 35例，T3-T4 65例；淋巴转移49例，无淋巴转移51例；Ⅰ-Ⅱ期36例，Ⅲ-Ⅳ期64例。另取距肿瘤边缘>2 cm的配对癌旁组织100例作为对照。本研究经陕西省核工业215医院伦理委员会批准。组织标本经患者本人知情签字。 病例纳入标准：①符合《消化系统肿瘤病理学和遗传学》制定的胃癌相关诊断标准；②术前均未进行放化疗；③所取配对癌旁组织无任何癌细胞浸润；④临床资料完整。排除标准：①术前确诊合并其他脏器有功能障碍性疾病或恶性肿瘤的患者；②术前服用影响研究指标的药物；③不接受随访；④免疫组化染色结果不佳。

1.2 研究方法

1.2.1 试剂：兔抗人FBN1多克隆抗体购自上海恒斐生物科技有限公司，SP免疫组化试剂盒均购自武汉纯度生物科技有限公司，DAB显色试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 检测方法：采用免疫组化SP法，切取100例胃癌及癌旁组织石蜡标本，厚度5 μm；将组织石蜡块在50 ℃温水中展平，然后用处理干净的载玻片捞片；68 ℃恒温箱烤片2 h；常规脱蜡、水化；80%甲醇卵孵10 min后，将切片置入0.01 mol/L缓冲液(pH6.0)中，进行水溶锅煮沸，时间为20 min。随后在室温条件下，使用5%BSA封闭液开展孵育，时间为30 min，甩干后，滴加一抗50 μl(FBN1 浓度为1∶100)，于4 ℃条件下过夜。室温下，将带有HRP标记的二抗50 μl加入后，静置1 h。滴加SP，37 ℃卵育1 h；(以上各步骤间均用PBS冲洗3次，每次5 min)，随后进行DAB显色，显色时间为10 min。将标本在水下进行冲洗，冲洗时间为10 min，随后使用苏木精开展复染操作，时间为2 min。最后进行常规的脱水、封片、镜检，在操作中对照采用PBS液代替一抗。

1.3 观察指标 ① FBN1蛋白在胃癌和癌旁组织的表达：FBN1定位于胃癌组织细胞浆或胞膜，出现黄色颗粒为阳性染色，阳性表达率根据细胞染色强度和阳性细胞占比进行计算。细胞染色强度计分标准：无显色0分，黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。按光学显微镜下(×400)阳性细胞百分率计分，阳性细胞<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项分值相加≥3分为高表达，<3分为低表达。②不同FBN1蛋白表达水平胃癌患者的临床病理特征分析： 临床病理特征包括年龄、性别、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤直径、肿瘤位置等。比较不同临床病例特征患者的FBN1蛋白表达情况。③FBN1蛋白不同表达情况胃癌患者的生存分析：电话随访100例行胃癌根治术的患者，随访时间以手术当天起至随访截止时间或患者死亡，随访截止时间为2019年5月31日。根据随访结果，比较FBN1蛋白高表达和低/阴性表达胃癌患者的生存时间。④影响胃癌患者术后生存的多因素分析：使用Cox回归分析影响胃癌患者术后生存的独立危险因素。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件进行分析。计数资料组间比较以[例(%)]表示，采用χ2检验。生存分析用 Kaplan-Meier，组间对比用Log-Rank 检验，使用Cox回归分析影响胃癌患者术后生存的独立危险因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FBN1蛋白在胃癌和癌旁组织的表达 胃癌组织中，FBN1蛋白阳性高表达61例，高表达率为61.00%，低表达31例，低表达率为31.00%，阴性表达8例，阴性表达率8.00%，阳性表达率92.00%。癌旁组织中FBN1蛋白高表达8例，高表达率8.00%，低表达32例，低表达率32.00%，阴性表达60例，阴性表达率60.00%，阳性表达率40.00%。胃癌组织中FBN1蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织(P<0.05)。FBN1在胃癌组织中阳性表达为肿瘤细胞浆或包膜有棕黄色颗粒，见图1A；FBN1在癌旁组织中的阴性表达见图1B。

A:胃癌组织FBN1阳性表达；B：癌旁组织FBN1阴性表达

2.2 不同FBN1蛋白表达水平胃癌患者的临床病理特征分析 胃癌组织中FBN1蛋白高表达患者的胃癌浸润深度T3-T4、淋巴结转移及TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期发生率明显高于FBN1蛋白低/阴性表达患者(P<0.05)。胃癌组织中FBN1蛋白高表达患者的年龄、性别、分化程度、肿瘤直径、肿瘤位置与FBN1蛋白低/阴性表达患者相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同FBN1蛋白表达水平胃癌患者的临床病理特征分析[例(%)]

2.3 FBN1蛋白不同表达情况胃癌患者的生存分析 100例胃癌患者均获得有效随访，随访时间2～65个月，中位随访时间33个月，随访过程中46例因胃癌死亡。FBN1蛋白高表达患者生存时间(35.30±2.70)个月，FBN1蛋白低/阴性表达患者平均生存时间(52.69±3.12)个月，经Log-Rank检验，FBN1蛋白高表达患者生存时间显著低于FBN1蛋白低/阴性表达患者(P<0.05)。见图2。

图2 FBN1蛋白不同表达情况胃癌患者的生存分析

2.4 影响胃癌患者术后生存的多因素分析 Cox回归分析显示，FBN1蛋白高表达、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化以及淋巴结转移均为影响胃癌患者术后生存的独立危险因素。见表2。

表2 影响胃癌患者术后生存的多因素分析

3 讨 论

胃癌属于世界上发生率较高的恶性肿瘤，严重危害者人类的身体健康，研究胃癌发生、发展机制，并进行有效的治疗在临床中意义重大[9]。然而，由于早期胃癌的隐匿性和民众筛查意识的缺乏，导致大多数胃癌患者确诊时疾病已发展到进展期。胃癌根治术仍是临床中对患者的主要推荐治疗方法，能够改善患者临床症状，延缓病情进展。但是研究发现，由于胃癌患者术后复发、转移率高，导致患者整体预后差、生存期较短[10-11]。近年来，靶向药物作为恶性肿瘤患者的补充治疗手段日渐备受重视[12]。因此，寻找新的药物靶点，改善胃癌患者预后及延长其生存期成为当今转化医学研究的热点。

原纤维蛋白(FBN)被发现参与了癌症的发病机制[13]。原纤维蛋白家族(FBN)由FBN1、FBN2、FBN3、FBN4等4个成员组成，主要分布于结缔组织中，属于细胞外基质中微纤维的主要成分[14]。FBN1作为纤维蛋白家族成员之一，是由位于常染色体15q21.1区域，长约230 kb，含有65个外显子的基因编码的是一个很大的细胞外基质糖蛋白，可以形成细长的丝状体,微纤维,它可以为组织提供结构支撑,形成皮肤弹性纤维和血管及储存转化生长因子β(TGF-β)蛋白[15]。一系列研究发现，FBN1主要作为促癌因子在众多肿瘤组织中广泛表达，通过Wnt/β-catenin信号通路及基质金属蛋白酶(MMPs)家族介导上皮间质转换途径影响胃癌的发生发展，其表达程度远高于相对应的正常组织，其表达水平及拷贝量的变化有可能与肿瘤的发生与发展存在关系，包括：结肠癌、卵巢癌、甲状腺癌、膀胱癌及胆管癌等[16-17]。目前FBN1在众多肿瘤组织中的过表达已有报道，然而有关FBN1在胃癌领域的研究报道甚少，通过胃癌中FBN1蛋白的研究能够扩充FBN1在肿瘤中的研究领域，而且有望发现胃癌新的标记物及治疗的新靶标。

本研究发现FBN1蛋白主要在胃癌组织细胞中的胞质和或胞膜中表达，且FBN1在胃癌组织中的表达水平明显高于配对癌旁组织(P<0.05)，研究结果与倪晓飞等[15]研究结果一致。Zhang等[18]也发现FBN1表达上调可能提示卵巢癌的早期复发和对铂类化疗的敏感性。Wang等[19]研究发现FBN1促进卵巢癌转移。Guo等[20]发现 FBN1启动子的甲基化状态是结肠直肠癌的一种高特异性、敏感的生物标志物。此外，本研究通过对FBN1蛋白表达情况与患者病理特征的相关性分析，发现FBN1蛋白的高表达和胃癌浸润T3-T4、TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期以及淋巴结的转移，具有明显的相关性，但与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤直径等因素无关。且肿瘤的浸润程度越深、有淋巴结转移、TNM分期越高，则患者FBN1蛋白的阳性表达水平越高，这说明FBN1可能作为一种促癌基因在胃癌发生发展机制中发挥着关键作用。但是FBN1在胃癌发生、发展过程中的具体机制仍需扩大样本进一步分析研究。

此外，对胃癌患者的预后分析发现，FBN1蛋白高表达的胃癌患者生存时间明显低于FBN1蛋白低/阴性表达的患者，且FBNI蛋白高表达为影响胃癌患者术后生存的独立危险因素，提示FBN1水平的上调可导致胃癌患者生存期变短，FBN1可作为判断胃癌患者预后的重要指标。然而，关于FBN1与胃癌患者预后判断中的应用价值还需深入研究。

综上所述，FBN1蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期密切相关，并可作为胃癌患者术后生存时间的评估指标。然而未来仍需开展更进一步的深入研究，以明确FBN1蛋白在胃癌预后判断和治疗方案指导中的意义。