地龙提取物通过抑制TGF-β1信号通路发挥抗肺纤维化作用研究

陈 宏，张 伟，郭建波，苏玉明，宋倩男，陈 群，赵 猛

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.哈尔滨市阿城区人民医院，黑龙江 哈尔滨 150300)

肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是由多种弥漫性肺间质疾病引起的肺组织病理改变，近年来多种中药复方提取物针对肺纤维化动物模型呈现出显著的治疗效果[1]。肺纤维化通常因为临床表现呼吸困难，进而会引发呼吸衰竭而死亡，一般发生后，存活时间相对都不长，面对这样的机制目前还没有比较明确的研究支撑。但近年来，随着对本病发病机制和病理生理变化的深入研究和分子生物学技术的应用，治疗上有了新的进展[4]。本研究主要运用地龙提取物对抑制TGF-β1(Ttransforming growth factor-β1，TGF-β1)信号通路诱导的肺泡上皮细胞的间质转化和肺成纤维细胞的活化，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞及培养液：RPMI1640 培养基购于Beijing Solarbio Science&Technology Co，Ltd，MEM 培养基购于博士德生物有限公司，胎牛血清购于浙江天杭生物技术有限公司，Human TGF-β1 为Pepro Tech Inc 产品。

1.1.2 抗体及试剂盒：E-cadherin 抗体、Collagen-Ⅰ 抗体以及 SABC 即用型免疫组化试剂盒均为博士德生物有限公司产品；Human Collagen Type Ⅰ ELISA Kit 和 Human Fi-bronectin (FN) ELISA Kit 均为Sangon Biotech Co.Ltd产品。

1.1.3 主要仪器：CO2培养箱(美国 Thermo公司)、酶标仪(美国 Thermo公司)。倒置荧光相差显微镜(Olympus CKX41-A32PH)、数码相机(日本 OLYPUS公司)。

1.2 地龙提取物对 A549 细胞和 MRC-5 细胞增殖的影响 MTT 法检测地龙提取物的细胞毒性。通过运用培养液，进行平均吸光度值进行检测，按照正常孔的平均吸光度值作为 100% ，其他孔的吸光度值除以正常孔的平均吸光度值，乘以 100%，作为每孔的生存率。将本实验的小鼠分为三组：正常组、TGF-β1组和地龙组，各10只。

1.3 TGF-β1诱导A549细胞的EMT及地龙提取物的干预 TGF-β1诱导A549肺泡上皮细胞的间质转化和MRC-5肺成纤维细胞的活化；圆形度定量法分析细胞形态，免疫细胞化学法检测细胞E-钙黏附素(E-cadherin，E-cad)和Collagen-Ⅰ蛋白的表达。

1.4 Collagen-Ⅰ和FN的Elisa检测 吸出每孔的培养液，×1000 g、4 ℃ 离心 10 min；上清液按照试剂盒说明书采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测培养液中的Collagen-Ⅰ和FN 含量，以ng/ml 表示。

2 结 果

2.1 地龙提取物对A549细胞圆形度、E-cad和Collagen-I蛋白表达的影响 见表1。对于A549细胞，与正常组比较，TGF-β1组圆形度和E-cad表达均显著降低(均P<0.01)，Collagen-Ⅰ表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1组比较，地龙组能显著抑制E-cad表达的下调(P<0.05)，地龙组能显著抑制Collagen-Ⅰ表达的上调(P<0.05)。

表1 地龙提取物对A549细胞圆形度、E-cad和Collagen-Ⅰ蛋白表达(IOD/Area)的影响

2.2 地龙提取物对MRC-5细胞Collagen-Ⅰ和FN蛋白表达的影响 见表2。对于MRC-5细胞，与正常组比较，TGF-β1组FN、Collagen-Ⅰ的分泌量均显著增加(均P<0.01)；与TGF-β1组比较，地龙组的上述两种蛋白的分泌量均显著减少(均P<0.05)。

表2 地龙提取物对 MRC-5细胞Collagen-Ⅰ和FN蛋白表达的影响(ng/ml)

3 讨 论

间质性肺疾病(Interstitial lung disease，ILD)可能是不明原因或是毒素、过敏原从外部侵袭所引起，如果潜藏的危险因素没有被发现，就会被诊断为原发性间质性肺炎[5-6]。肺纤维化是一种慢性发炎及渐进式间质纤维化的疾病[7-10]。整个肺纤维化疾病发展的过程中，发炎反应和间质细胞增生程度扮演很重要的角色，造成肺部表皮细胞或血管内皮的损伤，使正常结构破坏。接着是发炎反应及释出多种调控激素，如细胞激素，化学激素及生长因子等，这些会造成纤维母细胞的移位、增生和分泌更多的细胞外基质。IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、PDGF、IGF及TGF-β等是属于促发炎及纤维化的细胞激素，造成细胞外间质大量增加，逐渐变成纤维化[11-12]。

转化生长因子β1(TGF-β1)在肿瘤生物学中具有抑制肿瘤和促进肿瘤的双重作用。TGF-β1多肽类蛋白作为肿瘤抑制因子抑制上皮细胞、内皮细胞和造血细胞的增殖。在肿瘤发生发展过程中，它们对TGF-β1介导的生长抑制产生抵抗，并过表达TGF-β1[13-14]。此时，TGF-β1促进肿瘤生长和转移。TGF-β1多效性信号通路是开发肿瘤治疗靶向药物的一个挑战。目前，癌症治疗学的一些发展目标是在临床前和临床药物开发项目。上皮细胞-间充质转化(EMTs)发生在许多动物物种胚胎发育的关键阶段[15-16]。EMT为了解肿瘤向去分化和恶性阶段的进展提供了一个新的基础。由基底膜构成的正常上皮可在局部增生而形成腺瘤[16]。进一步的转变，由表观变化和遗传改变导致原位癌。进一步的改变可能通过上皮细胞-间充质转化引起局部癌细胞扩散，基底膜破碎。这些细胞可以通过静脉进入淋巴或血管，使它们被动运输到远处的器官[17]。分化标记的表达从E-钙黏蛋白等细胞连接蛋白转变为间充质标记，包括N-钙黏蛋白和纤维连接蛋白。此外，静止细胞转化为可通过细胞外基质侵袭的迁移细胞[18]。

中医学则将本病归入“咳嗽”“肺痿”“喘证”“肺胀”等范畴，是多种肺疾病发展到晚期共同的病理变化，主要病机在于虚、瘀，临床多见气阴不足，瘀血阻络。所以，中医治疗总以补肺生津，活血通络为原则，在文献中，我们可见养肺活血汤、血府逐淤汤、补气通肺饮等中药方[19]。相关研究[20]表明，中药复方对肺脾两虚型特发性肺纤维化大鼠模型有显著疗效，其机制主要是通过影响白细胞介素-8、肿瘤坏死因子-α等炎性因子的表达，改善或延缓肺泡炎症发展起到抑制炎症及肺纤维化的作用。地龙可用于肺热哮喘，可单用研末内服，或配伍使用。入肺经，又能清肺泄热而平喘[15]。主要成分本品含蚯蚓解热碱、蚯蚓素、蚯蚓毒素；尚含磷脂、胆固醇、维生素、蛋白质、氨基酸及黄嘌呤、腺嘌呤、胆碱等成分。地龙提取物地龙蛋白广泛用于临床，并越来越多地用于心脑血管、内分泌、呼吸系统等疾病的预防和治疗。通过本研究表明，对于A549细胞，与正常组比较，TGF-β1组圆形度和E-cad表达显著降低，Collagen-Ⅰ表达显著升高；与TGF-β1组比较，地龙组能显著抑制E-cad表达的下调，地龙组能显著抑制Collagen-Ⅰ表达的上调。对于MRC-5细胞，与正常组比较，TGF-β1组FN、Collagen-Ⅰ的分泌量显著增加；与TGF-β1组比较，地龙组的上述两种蛋白的分泌量显著减少。因此，地龙提取物抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞的间质转化和肺成纤维细胞的活化，提示地龙提取物可能具有抑制肺纤维化的形成和发展的作用。