通络散结汤对2型糖尿病大鼠调节性T细胞及炎症因子的影响

马红静，马民凯，马红建，陈新苗，侯冰洁

(保定市第四中心医院，河北 保定 072350)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由环境、遗传和自身免疫等多种致病因素导致的机体内代谢紊乱，胰岛素分泌缺陷或功能障碍引发胰岛素抵抗和缺乏，主要以血糖持续处于高水平状态为特征的临床综合征[1]。2型糖尿病病因复杂，患者由胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷，血浆胰岛素水平可正常或升高，通常可不依赖胰岛素治疗，多数患者可进行系统管理模式治疗，如医学营养治疗、规律的运动治疗及药物治疗等综合治疗，有助于控制血糖水平[2]。此型糖尿病的发病机制尚无统一定论，有报道称[3-4]，2型糖尿病的发生与遗传因素和环境因素关系密切，可影响胰岛功能的发挥，以胰岛素抵抗为主，出现一系列感染炎症性表现及代谢紊乱，可并发复杂性并发症。近年来，有关中医药治疗糖尿病的基础研究和临床报道越来越多，关于中药及其复方治疗糖尿病的机制研究亦不断深入。目前，中医药治疗糖尿病取得较为显著的疗效，对于抑制炎症反应、提高免疫功能及改善胰岛素功能体现了明显的效果，对糖尿病的治疗提供了有效的思路。本研究以中药复方通络散结汤为研究对象，对灌胃给予通络散结汤的2型糖尿病大鼠血及脾脏组织中炎症因子及T淋巴细胞表达情况进行了检测，阐明了通络散结汤治疗该病的作用机制，为临床应用提供了良好的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠50只，体重(190±10)g，雄性，购自北京维通利华实验动物中心[动物合格证号：SCXK(京)2002-0006]。

1.2 实验仪器、药物及试剂 药物：通络散结汤(黄芪40 g，生地黄15 g，党参、当归、夏枯草、僵蚕各10 g,丹参、牡蛎各20 g，川芎12 g，地龙5 g，水蛭粉1 g，甘草6 g) ，把上述药味采用常规水煎煮方法，以10倍量药材的水浸泡30 h，先大火煮沸以后小火继续煎煮1 h，过滤取滤液，残渣再加入10倍量的水煎 30 min，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1 g(生药材)/ml。试剂：链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)购于北京索莱宝公司；实验检测血清各炎症因子指标所需试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司；实验检测指标CD4+、CD8+所需ELISA试剂盒，均购自上海西唐生物科技有限公司；BCA蛋白测定试剂盒，购自美国Thermo公司；TNF-α抗体、IL-6抗体、CRP抗体、β-actin抗体及辣根过氧化物酶标记二抗均购自杭州弗德生物技术有限公司；ECL发光液和硝酸纤维素膜，购自美国Millipoer公司。仪器：G-421-1型血糖仪购置爱奥乐医疗器械有限公司；SpectraMax iD5-多功能酶标仪(上海美谷分子)；H1650R台式高速离心机(湖南湘仪)。

1.3 实验动物模型建立 SD大鼠50只，体重(190±10)g，均于标准实验室基础饲料适应性喂养1周后，按照随机数字表法随机分组，即正常对照组(M组)10只和高脂高糖饲料组40只。造模方法：M组大鼠持续予SPF级饲料喂养，其余造模组大鼠均给予高糖高脂高营养饲料(高糖高脂饲料配比为：猪油16.5%，白糖20%，胆酸钠1.5%，胆固醇2%，高营养饲料60%)喂养，连续8周。8周后，禁食12 h，高脂高糖饲料组大鼠一次性腹腔注射1%链脲佐菌素溶液(60 mg/kg)，M组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。继续喂养72 h，依据大鼠空腹血糖即尾静脉血糖≥16.7 mmol/L为判定造模成功标准。造模成功后，共筛选糖尿病模型大鼠30只，分为：模型对照组(N组)10只；通络散结汤高剂量组(S组)10只、低剂量组(T组)10只。

1.4 动物分组及给药 通络散结汤大鼠用药剂量根据《中药药理方法学》人和动物按体表面积折算的等效剂量以及高、低剂量计算法确定。S组(10 g/kg，按生药材量计)、T组(5 g/kg)组，采用灌胃途径按照各组药物剂量给药，N组和M组予等体积生理盐水代替灌胃，每天2次，连续2周，期间各组大鼠正常饮食。

1.5 取材及检测指标 灌胃给药结束后，各组大鼠均禁食12 h，可不禁水，于大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)使其麻醉，抽取腹主动脉血，常温静置2 h于4 ℃离心，离心后取上清液用于检测血清(Fasting plasma glucose，FBG)、TC、TG、TNF-α、IL-6、CRP、CD4+、CD8+等浓度。随后于实验室解剖台上快速摘取大鼠脾脏，用生理盐水进行冲洗，吸干水分，液氮中保存，用于Western blotting法检测，步骤如下：取处理好的脾脏组织，混入组织裂解液，震荡裂解为看不见的颗粒，离心提取蛋白，于沸水中煮沸10 min，冷却离心后取上清液加入制备好的凝胶，放入槽内进行电泳，浸入转膜液中转膜，后放入盛有配好的牛奶的器皿中室温封闭过夜，稀释适当比例的一抗稀释液(CD4+、CD8+、β-actin均为1∶1000)室温孵育2 h，取PVDF膜浸入稀释后的辣根酶标记的二抗(稀释浓度为1∶5000)溶液室温孵育1 h，最后扫膜压片成像并进行灰度值分析，以β-actin为内参，结果以目的蛋白灰度值(β-actin)灰度值表示。

2 结 果

2.1 通络散结汤对2型糖尿病大鼠血糖血脂水平的影响 见表1。与M组比较，N组大鼠血清中FBG、TC、TG等血糖及血脂水平均显著升高(P<0.05)；与N组比较，S组、T组大鼠血清中FBG、TC、TG等血糖及血脂水平均显著降低(P<0.05)。

表1 通络散结汤对2型糖尿病大鼠血糖血脂水平的影响(mmol/L)

2.2 通络散结汤对2型糖尿病大鼠血清中炎症因子浓度的影响 见表2。与M组比较，N组大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP浓度均显著升高(P<0.05)；与N组比较，S组、T组大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP浓度均显著降低(P<0.05)。

表2 通络散结汤对2型糖尿病大鼠血清中炎症因子浓度的影响

2.3 通络散结汤对2型糖尿病大鼠血清中CD4+、CD8+T淋巴细胞表达的影响 见表3。与M组比较，N组大鼠血清中CD4+T淋巴细胞浓度显著升高(P<0.05)，CD8+浓度均显著降低(P<0.05)，CD4+/CD8+比值显著升高；与N组相比，S、T组CD8+浓度显著升高(P<0.05)，CD4+/CD8+比值显著降低(P<0.05)。

表3 通络散结汤对2型糖尿病大鼠血清中CD4+、CD8+T淋巴细胞表达的影响

2.4 通络散结汤对2型糖尿病大鼠脾脏组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞蛋白表达的影响 与M组比较，N组大鼠组织中CD4+浓度显著升高，CD8+浓度显著降低(P<0.05)；与N组比较，S组、T组D4+水平均显著降低(P<0.05)，CD8+水平均显著升高(P<0.05)。见图1。

注：与M组比较，*P<0.05；与N组比较，#P<0.05

3 讨 论

中医方面，糖尿病可归属于“消渴病”范畴，消渴病属于慢性病，部分患者可发展为医“消渴病心病”“消渴病肾病”。其主要病因病机为：饮食失节、情志失调、劳力损伤等导致气血阴阳失调，导致气滞、血瘀、痰浊、寒凝等痹阻心脉与肾络，血瘀气滞，脉络不通，心阳肾阳不足，故疲倦乏力，血瘀气滞，脉络不通。基于此理论，消渴病实属本虚标实之证，本虚以心脾肾亏虚为主，标实指痰浊、水湿、瘀血、毒邪等，宜以补虚扶弱、活血化瘀为临床治则之一[6]。本研究中所用方剂由黄芪、党参、生地黄、当归、丹参、川芎、地龙、水蛭、牡蛎、夏枯草、僵蚕、甘草组成，具有益气养阴、通络散结的功效。现代药理研究证明，方中诸多药味均具有调节血糖水平和改善血液流变学特征作用，黄芪可有效降低T2DM大鼠血糖水平，降低炎症因子释放，调控炎症反应，改善胰岛素抵抗，控制T2DM的进展[7]；生地黄对调节细胞葡萄糖自身平衡有显著作用，另外还可调节肠道菌群，使机体内各种菌群处于平衡状态[8]；丹参能改善微循环，加快血液流速、增加血流量作用[9]；水蛭可通过和凝血酶的直接结合而发挥抗凝抗凝、抗栓、纤溶作用[10]；牡蛎除具有降糖作用外，对四氧嘧啶所致的小鼠胰腺细胞也有一定的保护作用[11]。

T淋巴细胞是由人体多能干细胞分化而来，经血液循环分布至各免疫器官，其数量稳定且比值保持动态平衡，通过血液及淋巴管等再循环，发挥有效的免疫调节功能，维持机体免疫系统平衡。CD4+是一种标志性辅助性T细胞，可辅助并调控其他淋巴细胞免疫反应；CD8+是一种标志性细胞毒性T淋巴细胞，可杀灭受到感染的细胞，维持机体免疫应答，机体的免疫功能可用CD4+/CD8+来表示，其比值高低代表机体免疫机能的强弱，二者成正比关系[3]。研究发现[3]，2型糖尿病患者血糖持续处于高水平状态，影响机体T淋巴细胞的成熟、分化及功能，使其总数下降，CD4+/CD8+失调，降低CD4+T淋巴细胞增殖、释放，抑制其免疫应答，导致免疫系统紊乱，促进胰岛β细胞损伤，胰岛功能障碍，产生抗体，或分泌胰岛素失衡，出现胰岛素抵抗，加重糖尿病的进展[8]。本试验结果显示，与M组相比较，N组大鼠血清炎性因子CD4+浓度显著升高，CD8+浓度显著降低，与N组相比较，S组、T组大鼠血清炎性因子CD4+浓度均显著降低，CD8+浓度显著升高，表明糖尿病大鼠细胞免疫功能降低，通络散结汤可纠正糖尿病大鼠免疫失控状态，改善细胞免疫功能。

糖尿病的发病机制十分复杂，尚不十分明确，目前多数研究发现炎症学说参与其发病[12]。研究表明，2型糖尿病患者由于持续高血糖水平可诱发炎症反应，属于慢性炎症性疾病[13-14]。炎症因子可作为始动因素，与胰岛素抵抗的发生关系密切，大量炎症因子通过抑制其磷酸化，减少胰岛素受体，阻碍葡萄糖转运途径，降低胰岛素效应，发生高胰岛素血症。此外，机体处于炎症环境下，异常表达的炎症因子可作用于胰岛素信号通路，干扰并抑制其信号转导，引发胰岛素抵抗[15]。炎症因子中，与糖尿病的发生发展关系密切的指标为TNF-α、IL-6、CRP，TNF-α是由活化的单核巨噬细胞分泌的一种蛋白，可激活和刺激其他炎症因子的分泌，产生强烈的炎症反应，其信号传导活跃，干扰胰岛细胞内信号通路；CRP是一种炎症性蛋白质，介导NF-κB产生炎症反应，促使炎症因子的合成、释放，进一步加重胰岛素抵抗，代谢功能紊乱，致使内皮细胞受损，诱发转移抑制因子的产生，从而导致糖尿病及其并发症的发生和发展[16]； IL-6是由活化的成纤维细胞和T淋巴细胞产生的一类细胞因子，功能广泛，具有调节免疫和促进炎症反应作用，能够溶解脂肪细胞，损伤胰岛β细胞，导致其凋亡，从而降低胰岛素受体数目，抑制糖、脂肪代谢，进而使胰岛素信号通路受到阻碍，导致胰岛素抵抗[17]。本试验结果显示，与M组相比较，N组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-6、CRP水平均明显升高，与N组相比较，S组、T组大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6、CRP水平均明显降低，表明处于高血糖水平的2型糖尿病大鼠体内存在各种炎症反应，与目前文献报道相一致[18]，而通络散结汤可降低2型糖尿病大鼠体内相关炎症因子水平，缓解炎症反应，改善2型糖尿病。