藿苓益智方对阿尔茨海默病模型小鼠神经细胞凋亡线粒体通路的作用研究

吴 鹏，邢俊娥，曹凌群，李少琳，熊 赟

(1.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学，广西 南宁 530001)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)，又称老年痴呆病，是一种最常见的中枢神经系统退行性疾病，随着疾病的不断发展严重危害着患者的身心健康，是痴呆病中最常见类型[1]。AD在临床上最特征的表现为：进行性的记忆力减退、认知功能障碍和人格改变等。随着我国人口老龄化，AD的发病率有逐年提高的趋势[2]。该病病因迄今不明、发病机制也较为复杂，目前研究尚未证实其特定的有效作用机制，主要是以一些假说为主，包括：β淀粉样蛋白(Amyloid β,Aβ)瀑布假说、Tau蛋白假说、基因突变及线粒体功能障碍假说、炎性机制和氧化应激假说等，在上述假说中线粒体功能障碍在AD的早期改变中最具有特征性，可能是今后一段时间研究的热点和治疗的靶点[3-6]。本课题基于“线粒体障碍假说”发病机制出发，应用多年的临床经验方藿苓益智方探讨AD小鼠脑内线粒体通路神经细胞凋亡的调控作用，具体的实验方法和结果如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康雄性SPF级SD小鼠100只，体重：(150±45)g，鼠龄：1～2个月，动物由广西中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号:SCXK(桂)2005-0003。对所有动物的处置完全符合2006年由科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.1.2 药物及试剂：藿苓益智方由茯苓、刺五加、淫羊藿、山药4味中药组成，由我院药剂科统一采购，并按照藿苓益智方的比例和提取工艺进行提取，浓缩，干燥，备用。盐酸多奈哌齐片[卫材(中国)有限公司制造，国药准字H20070181]。Aβ25-35由北京博奥森生物技术有限公司提供。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒由美国Genzyme公司提供。四甲基偶氮唑盐(MTT)由河北博海生物工程公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法：采用Aβ的活性片段Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡建立AD的细胞模型PC12细胞。用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的双抗配成一定比例的DMEM培养基，后进行分装封口处理，培养基置于5%CO2、37 ℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养。每4～5 d进行1次细胞传代，传代时取对数生长期的细胞，用0.25胰酶将其加入到培养瓶中，轻微摇动培养瓶让培养基细胞充分和胰酶接触，然后再次放入培养箱约2 min后取出，在显微镜下观察细胞突起开始收缩变圆时重新加入含血清的培养基中终止细胞消化，移液枪完全将细胞吹散，收集细胞液离心，离心后重新加入新鲜的培养基吹打成细胞悬液，然后将细胞悬液倒入15 ml离心管中，1000 r/min离心10 min去除上清液，将新鲜培养基重悬细胞后接种于96孔培养板中，24 h后再次除去旧的培养基，加入不含血清的Aβ25-35培养基继续在CO2培养箱中培养24 h后用于各项指标检测。

1.2.2 动物分组：本实验设置六组，即对照组、Aβ25-35组、Aβ25-35+盐酸多奈哌齐组、Aβ25-35+藿苓益智方提取物低剂量组(50 μg/ml)、藿苓益智方提取物中剂量组(100 μg/ml)、藿苓益智方提取物高剂量组(200 μg/ml)。对照组：DMEM培养基中培养48 h；Aβ25-35组：先在DMEM培养基中培养24 h，然后换成含有20 μmol/L Aβ25-35的DMEM培养基继续培养24 h；Aβ25-35+正常血清组：正常血清预处理24 h后加入20 μmol/L Aβ25-35的DMEM培养基继续培养24 h；Aβ25-35+盐酸多奈哌齐组、Aβ25-35+藿苓益智方提取物组预处理24 h后加入20 μmol/L Aβ25-35的DMEM培养基继续培养24 h。

1.3 细胞存活率测定 采用MTT法检测各组细胞存活率，观察藿苓益智方提取物对Aβ25-35诱导的神经细胞活性的影响。收集PC12细胞，按1.2.2所示的方法分组培养并处理细胞，根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

1.4 凋亡定量检测 采用流式细胞仪，Annexin V/PI双染法检测各组神经细胞凋亡数量。收集 PC12细胞，按1.2.2所示的方法分组培养并处理细胞，培养结束后，离心收集细胞于离心管内，孵育缓冲液洗涤1次，离心5 min弃上清液，加入100 μl Binding Buffer悬浮细胞，室温下孵育20 min，然后再进行离心冲洗，最后加入10 μl Annexin V-FITC和Propidium Iodid混匀，4 ℃避光反应20 min，并不时振动，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 线粒体超微结构检测 采用Hoechst 33342染色，透射电镜检测各组神经细胞线粒体超微结构变化。收集PC12细胞，按1.2.2所示的方法分组培养并处理细胞，培养结束后，用倒置荧光显微镜对各组细胞进行形态学观察分析。

2 结 果

2.1 细胞存活率测定结果 本实验采用MTT法检测藿苓益智方提取物(50、100、200 μg/ml)以及盐酸多奈哌齐片对PC12细胞活性的影响。结果如图1所示，Aβ25-35组与对照组相比较细胞存活率显著降低(P<0.01)；藿苓益智方提取物50 μg/ml组的细胞存活率与Aβ25-35组相比有一定的增高(P<0.05)；盐酸多奈哌齐组和藿苓益智方提取物(100、200 μg/ml)与Aβ25-35组相比，细胞存活率显著升高(均P<0.01)，但藿苓益智方提取物200 μg/ml升高的更明显。

2.2 凋亡的定量检测结果 本研究利用流式细胞仪、Annexin V/PI双染法对PC12细胞的凋亡情况进行了定量分析。实验结果如图2所示，对照组细胞几乎完好无损、Aβ25-35组细胞凋亡率则显著升高(38.1%)。藿苓益智方低、中、高剂量+Aβ25-35组细胞凋亡率则逐步下降至23.8%、16.2%、7.4%，盐酸多奈哌齐组下降至7.3%，与Aβ25-35组相比均具有统计学差异。以上研究结果提示：藿苓益智方中、高剂量组能够有效地抑制Aβ25-35对PC12细胞的损害，能有效地对神经细胞起到保护作用。

注： 与对照组比较，*P<0.01；与Aβ25-35组比较，△P<0.05，#P<0.01

2.3 线粒体超微结构检测 线粒体超微结构检测结果如图3所示，经Hoechst 33342染色后，对照组细胞核均匀淡染呈圆形低强度蓝色荧光，边缘清晰；而Aβ25-35组细胞核出现较多深染固缩、核浓缩、不规则以及裂解的现象，凋亡细胞数目明显增加，呈现凋亡的典型特征。与Aβ25-35组，盐酸多奈哌齐组细胞凋亡的数目下降明显，同时藿苓益智方低、中、高剂量+Aβ25-35组上述现象在逐步缓解，细胞凋亡数目均有所减少，且呈剂量依赖性趋势，表明藿苓益智方对Aβ诱导的PC12细胞凋亡具有明显的抑制作用。

注：与对照组比较，*P<0.01；与Aβ25-35组比较，△P<0.05，#P<0.01

图3 各组细胞线粒体超微结构(HE染色，×400)

3 讨 论

AD是一个复杂的多因素综合病症,中医药尤其复方中药在治疗AD方面具有一定优势，往往可以很好的起到多靶点调控的作用。通过我们十多年来的研究发现AD患者不仅在认知障碍，而且大部分患者有人格和情感障碍，同时临床上很多患者都有纳差，大便溏等情况，这些临床表现特征符合脾肾亏虚及心神不定的表现，同时研究发现中医的“脾主运化”与线粒体能量生成存在也密切联系[7-10]，因此，我们提出了AD治疗当以补肾健脾、安神益智为主。

根据上述理论我们研制出中药验方藿苓益智方，该方主要组成：刺五加、淫羊霍、茯苓、山药等。其中淫羊藿具有补肾壮阳，益精安神作用，既可温肾补阳、又可暖脾土，陈仕检等[11]应用淫羊藿苷对AD大鼠模型干预后发现可改善AD的症状。茯苓有宁心、健脾、利水渗湿的作用，脾的健运功能正常则痰浊不生，瘀血不滞，血脉能正常运行。研究显示茯苓多糖主要通过抑制脑内乙酰胆碱酯酶合成，从而提高乙酰胆碱活性以起到改善学习记忆[12]。刺五加在《本草纲目》中被描述为“本经上品”，研究发现[13]具有补气、抗衰老、抗疲劳、强意志的功能，杨坦等[14]研究发现刺五加皂苷能明显改善衰老大鼠的学习记忆功能。山药，性平稳，具有补脾养胃、益肺生津、补肾涩精的功效，具有抗氧化、抗衰老等药理作用。上述药相辅相成，补肾健脾，延缓衰老。

本实验提示藿苓益智方对AD的治疗中可对Aβ诱导的PC12细胞凋亡具有明显的抑制作用，改善细胞存活率，减少线粒体细胞凋亡。人体的细胞中几乎都存在着线粒体，线粒体作为细胞的动力站能源源不断产生能量，为细胞的生命活动提供大约95%的能量[15-16]。我们通过查阅文献发现线粒体异常是AD病理的早期特征[17]。AD患者脑内出现大量神经元丢失的重要原因之一是神经细胞的凋亡[18]，细胞凋亡是机体组织为了清除衰老或受损细胞的自我保护的一种方式，凋亡信号的不同在细胞中也同样引发不同的凋亡转导通路，其中本课题研究的线粒体通路是细胞凋亡的内源性通路，实验研究表明在细胞凋亡调控活动中线粒体占据着中心的地位，其在凋亡程序化死亡信号传导途径中起关键的调节作用[19-20]。通过本实验我们发现：藿苓益智方可提高细胞存活率，减少细胞凋亡，同时能够有效地抑制Aβ25-35对PC12细胞的毒性，阻止并延缓AD的进展。