Pygo2、M2BPGi在慢性乙型肝炎肝纤维化患者血清中的表达及联合诊断价值

于丽华，王 宏，秦 丽，张冬梅，崔东燕，赵书平

(1.海军青岛特勤疗养中心检验科，山东省青岛市 266071；2.泰安市中心医院检验科，山东省泰安市271000)

肝纤维化是肝细胞变性或坏死后机体发生的正常修复过程，其病理表现为纤维结缔组织在肝脏组织中过度沉积[1]，而慢性乙型肝炎患者均伴有不同程度肝纤维化，若不及时有效控制病毒感染程度，肝纤维化会进展成肝硬化、肝癌等疾病，严重威胁患者生存质量和生命安全[2]。若及时判断乙肝患者纤维化分期，并对症干预治疗，将会逆转肝脏纤维化程度，降低肝硬化、肝癌等疾病发生率，进而提高患者生存质量[3]。目前临床上以肝穿刺病理组织活检为肝纤维化诊断的金标准，可有效诊断出肝纤维化病理分型，但其具有入侵性，患者依从性较差[4]。而血清指标因其检测快捷、耗时短及创伤小被临床推广，传统肝纤维化血清诊断指标虽具有快速、便捷的特点，但易受外界环境的干扰，诊断效能较低[5]。因而找寻高特异度和灵敏度的血清指标，对提高肝纤维化临床检出率具有重要的作用。人尾肢同源蛋白2(human pygopus homolog 2, Pygo2)在肝纤维化进程中发挥重要作用，有临床研究证实其血清表达可反映肝纤维化病理分型[6]。Mac-2结合蛋白糖基化异构体(Mac-2 binding protein glycosylation isomer, M2BPGi)是一种广泛分布于机体组织液、血液中的糖蛋白，其在肝纤维化患者体内呈异常表达状态[7]。上述指标均可反映肝纤维化程度，但其联合检测乙肝肝纤维化的研究相对较少，本文对Pygo2、M2BPGi在慢性乙型肝炎肝纤维化患者血清中的表达及联合诊断价值进行研究，旨在为临床研究提供依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2016年5月—2019年2月本疗养中心收治的慢性乙型肝炎患者345例纳入乙肝组，根据肝穿刺活检病理结果，按肝纤维化分期将乙肝组分成S0组(n=49)、S1组(n=94)、S2组(n=53)、S3组(n=87)及S4组(n=62)。对照组为同期119例正常健康志愿者的血液样本。本研究经本中心伦理委员会批准，所有研究对象及家属知情同意。

纳入标准：①所有患者均符合慢性乙型肝炎诊断标准[8]，有乙肝疾病史，乙肝表面抗原阳性表达时间>6个月；②接受肝穿刺活检，并应用2000年《病毒性肝炎防治方案》中拟定的肝纤维化分期标准[9]分组，临床病理资料齐全。

排除标准：①合并丙型肝炎等其他病毒性肝炎者；②合并患有恶性肿瘤者；③合并患有自身免疫疾病、神经系统或血液系统疾病患者；④酗酒或吸毒者；⑤不配合者。

1.2 肝纤维化病理分期标准

根据中国2000年肝纤维化分期标准[9]：S0期无纤维化；S1期汇管区纤维化扩大，限局窦周及小叶内纤维化；S2期汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留；S3期纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；S4期早期肝硬化。

1.3 血清Pygo2和M2BPGi检测

所有研究对象均于入组时采集空腹外周肘静脉血4 mL，置于含促凝剂的分离胶黄头管中，应用Allegray 64R Centrifuge型离心机(美国Beckman Coulter)以3 000 r/min离心10 min，获得血清分装，-70 ℃保存，备用。应用全自动酶标仪(美国Thermo Multiskan公司，FC型)酶联免疫法测定血清Pygo2和M2BPGi水平，试剂盒来自于上海江莱生物科技有限公司。

1.4 Pygo2和M2BPGi ROC曲线

以肝组织活检为金标准[9]，绘制血清Pygo2和M2BPGi单独及联合诊断的ROC曲线，同时采用平行联合诊断方式，即任一指标为阳性，即可诊断为肝纤维化。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 两组一般资料的比较

两组受试者年龄、体质量指数及性别等一般资料差异无统计学意义(P>0.05；表1)。与对照组比较，乙肝组谷草转氨酶、谷丙转氨酶、Pygo2和M2BPGi水平差异有显著性(P<0.05)。

表1 两组一般资料的比较

2.2 各组血清Pygo2和M2BPGi水平的比较

与对照组比较，S0～S4组乙肝患者血清Pygo2和M2BPGi水平均明显提高(P<0.01；表1)。随着肝纤维化分期升高，血清Pygo2和M2BPGi水平升高(P<0.01)，且不同肝纤维化分期之间两两比较，差异均有显著性(P<0.01；表2)。

表2 各组患者血清Pygo2和M2BPGi水平的比较

2.3 血清Pygo2和M2BPGi与肝纤维化病理分期的相关性

相关性分析显示，血清Pygo2、血清M2BPGi与肝纤维化分期均呈正相关(r=0.894,P=0.000；r=0.912,P=0.000)，箱线图见图1。

图1 血清Pygo2和M2BPGi与肝纤维化病理分期相关性箱线图

2.4 血清Pygo2和M2BPGi回归分析及临床诊断价值

分别以血清Pygo2和M2BPGi为自变量，以是否为S1和是否为S2为因变量，行非条件Logistic回归分析，拟合得到回归方程分别为logit(PS1)=-0.671+0.873XPygo2+0.892XM2BPGi和logit(PS2)=-0.701+0.873XPygo2+0.887XM2BPGi，结果见表3和表4。

表3 血清Pygo2、M2BPGi与S1分期的Logistic回归分析

表4 血清Pygo2、M2BPGi与S2分期的Logistic回归分析

2.5 血清Pygo2和M2BPGi单独及平行联合诊断价值的比较

以血清Pygo2和M2BPGi作为检验变量，分别以S1和S2为状态标量，以灵敏度为Y轴，以“1-特异度”为X轴分别绘制ROC曲线(图2)。

图2 血清Pygo2和M2BPGi单项检测及联合诊断的ROC曲线图

根据ROC曲线，血清Pygo2诊断S1的AUC为0.826(95%CI 0.774～0.877)。血清M2BPGi诊断S1的AUC为0.784(95%CI 0.758～0.810)。平行联合检测S1的AUC为0.903(95%CI 0.804～0.899)。血清Pygo2诊断S2的AUC为0.829(95%CI 0.779～0.867)；血清M2BPGi诊断S2的AUC为0.793(95%CI 0.763～0.815)。平行联合检测S2的AUC为0.908(95%CI 0.799～0.919)。

平行联合检测灵敏度显著高于各指标单独检测(P<0.05)，且联合诊断的AUC显著高于各项指标单独检测(P<0.05)，平行联合诊断时，任一指标为阳性，即可诊断为S1或S2(表5和表6)。

表5 Pygo2、M2BPGi单项和联合检测AUC的比较

表6 Pygo2、M2BPGi单项及联合检测诊断价值的比较

3 讨 论

流行病学研究显示，全世界约有2.4亿乙肝患者，而其中40%患者会发展成肝硬化、原发性肝癌等疾病，严重降低患者生命安全[10-11]。文献[12]研究表明，肝纤维化是病毒侵袭肝细胞所产生的正常修复生理反应，是慢性肝病发展、恶化成肝硬化和肝癌等疾病的中间病理过程，具有可逆性特点，因而临床诊断肝纤维化分型对疾病治疗和预后恢复有重要的意义。目前临床上多以影像学、血清学和肝组织活检等手段诊断肝纤维化程度，弹性超声等影像学技术具有无创、检测方便等特点，对肝纤维化分型诊断具有重要意义，但其专业度高，设备昂贵，患者依从性较低[13]。血清学指标因其具有方便、快捷及无创等特点已在临床得到广泛应用。传统的肝纤维化血清学指标为透明质酸酶、层黏连蛋白、Ⅲ型前胶原氨基末端前肽和Ⅳ型胶原，但其单独诊断效能较低，而这些指标联合诊断较为复杂，且其诊断结果仍需结合其他指标进一步判断[14]。而血清Pygo2和M2BPGi均与肝纤维化发生、发展及恶化有一定的相关性，且有研究证实，其可应用于肝纤维化诊断，且诊断效能较高，但其具体在慢性乙肝患者体内表达及其单独、联合诊断肝纤维化程度的研究相对较少[6,15]。

Pygo2蛋白是临床新近发现的Wnt信号通路片段，可在细胞增殖分化、基因转录及炎症反应中发挥重要作用。当乙肝病毒等侵袭机体肝细胞后，持续病毒感染会激活机体炎症反应，进而诱导并激活肝星状细胞生物学功能，引发机体肝纤维化病症的形成[16]。Tokunaga等[17]研究证实，Wnt/β-catenin信号通路在肝星状细胞的活化和肝纤维化的发生、发展中发挥关键功能，而Pygo2蛋白作为上述通路的关键组成结构，可有效调控基因转录和表达，进而增强肝星状细胞表达水平，加重机体肝纤维化病变程度，且朱传龙等[18]研究表明，血清Pygo2与丙肝肝纤维化程度呈明显正相关。本文研究表明，随着肝纤维化的进程，血清Pygo2水平逐步提高，证实血清Pygo2与肝纤维化的发生、发展有关，且血清Pygo2与肝纤维化呈正相关。进一步比较其诊断效能发现，血清Pygo2可有效预测机体肝纤维化，其单独诊断的灵敏度和特异度仍较低，可能与Pygo2参与细胞增殖分化、基因转录过程等有关，因而需联合其他因子以提高疾病诊断效能，与文献[19]研究丙肝患者肝纤维化诊断结果相近。

M2BPGi是一种糖蛋白异构体，可广泛分布和存在于机体细胞液、组织液及血液中，具有细胞免疫、组成抗原及提高蛋白质亲水性等生物学功能[19]。M2BPGi是分泌性糖蛋白，可结合机体半乳凝素、胶原蛋白及纤连蛋白等物质，促进乙肝肝纤维化的发生和发展。Sato等[20]研究表明，M2BPGi水平在慢性肝病发展过程中逐步升高，因而其被临床用于肝硬化、肝癌等疾病诊断。而肝纤维化病理研究表明[21]，肝星状细胞可分泌合成M2BPGi，不受其他器官影响，具有良好的肝特异性。本文研究结果表明，随着肝纤维化的进程，血清M2BPGi水平逐步提高，证实血清M2BPGi与肝纤维化进程有关，且Mark等[15]证实血清M2BPGi表达与肝纤维化进程呈正相关，同时M2BPGi与紫藤多花凝集素特异性结合，共同参与肝纤维化的发生、发展及恶化过程。本研究表明，血清M2BPGi与肝纤维化呈正相关，进一步比较其诊断效能发现，血清M2BPGi可有效诊断机体肝纤维化及其病理进程，与文献[22]研究丙肝患者肝纤维化诊断效能接近。

血清Pygo2和M2BPGi均是肝纤维化诊断的有效指标，单独检测诊断效能偏低，近年来相关研究证实多技术手段或多指标联合诊断可提高肝纤维化诊断效能[22-24]，因而本文平行联合检测血清Pygo2和M2BPGi，任一指标为阳性即可判定为存在肝纤维化或明显纤维化。本研究结果表明，平行联合检测的灵敏度明显高于各指标单独检测，且保持一定的特异度和准确度。同时，本研究应用Logistic回归综合分析多项指标，可综合提高诊断效能。本研究结果基于345例慢性乙型肝炎患者，纳入样本量和样本来源较为局限，仍需进一步扩充样本量，纳入多研究中心样本，以验证结果的可靠性和准确性。

综上所述，血清Pygo2和M2BPGi二者单独检测对肝纤维化临床诊断具有重要意义，且平行联合检测可提高肝纤维化诊断灵敏度，为肝纤维化早期诊断提供快速、便捷及准确的方法。