Erbin在肺鳞状细胞癌组织中的表达及其与患者预后的关系

张 丹，田 姗，李 翔，牟尚东

(三二〇一医院肿瘤内一科，陕西省汉中市723000)

肺癌是对人类威胁最大的恶性肿瘤之一，近年其发病率和死亡率增长快，根据全球数据统计，每年新增肺癌确诊患者约100万人，约80万人因肺癌死亡[1]。在中国，肺癌为排名第一位的恶性肿瘤，其病因至今尚未完全明确，多数学者认为与长期吸烟密切相关[2]。肺鳞状细胞癌是肺癌常见类型，经肿物切除、内分泌治疗、放化疗等传统治疗手段治疗后，生存率有所提高，但治疗效果仍不理想。因此，从肺癌发病机制寻找突破口，研究其特异性生物学标志物和治疗靶标具有重要意义[3]。本研究对80例肺鳞状细胞癌组织、80例癌旁正常肺组织的临床特征及生存资料进行回顾性分析，探讨Erbin在肺鳞状细胞癌中的表达及其与患者预后的关系，为提高其临床诊治水平提供参考依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取本院2011年3月—2015年3月手术切除的80例肺鳞状细胞癌组织以及同期80例癌旁正常肺组织标本，均经病理确诊，所有患者术前均未经过化疗或放疗。肺鳞状细胞癌组织80例，其中男51例，女29例，年龄35～84岁，中位年龄62岁，平均(57.3±6.1)岁；其中高分化28例，中分化32例，低分化20例；TNM分期[4]：Ⅰ期19例，Ⅱ期23例，Ⅲ期38例。同期癌旁正常肺组织80例，均距离肿瘤边缘5 cm以上，经病理证实无肿瘤细胞浸润；其中男49例，女31例，年龄36～84岁，中位年龄62岁，平均(57.27±8.08)岁。本研究通过本院医学伦理委员会批准，患者及家属知情同意。

所有患者均以门诊复查、电话等方式随访，随访资料完整，剔除中途退出研究或失访患者。随访时间为2015年3月—2020年3月，随访周期为第1年每3个月1次，第2～3年每3～6个月1次，第3～5年每6个月1次，5年后1年随访1次，生存时间以月为单位计算。

1.2 主要试剂

Erbin检测应用兔抗人多克隆抗体Erbin，购自英国Abcan公司，显色剂为二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)和PV9000免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)二抗试剂盒均购自福州迈新生物公司。

1.3 临床资料的搜集

通过查阅患者住院记录、各种辅助检查单、随访记录等病案资料，采用统一调查表摘录相关内容，主要内容包括年龄、性别、TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、转移情况、末次随访时间和生存时间等。

1.4 免疫组织化学染色

石蜡包埋切片处理，复染脱水处理，采用高压修复抗原，切片与一抗Erbin在4 ℃条件下孵育过夜，Erbin使用滴度为1∶100。第2天经过磷酸缓冲盐溶液冲洗后，进行苏木精伊红(HE)染色和DBA显色处理，最后显微镜下观察。

1.5 免疫组织化学结果判断

Erbin阳性表达判断标准：在肿瘤细胞胞质或胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性。由病理科医师选择肿瘤和癌旁正常肺组织的蜡块做切片，染色成功后显微镜下任意选择5个视野，每个视野下计数100个细胞。根据细胞阳性着色强弱，未出现着色记为0分；浅黄色或者黄色记为1分；棕黄色记为2分；棕褐色记为3分。阳性细胞百分数分级：阳性细胞<10%为0分，10%～30%为1分，30%～60%为2分，≥60%为3分。最后综合阳性强度和阳性细胞数评分，以两者的乘积为最后得分。0～1分为Erbin阴性表达，2～12分为Erbin阳性表达[5]。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 两组Erbin表达的比较

正常肺组织免疫组织化学染色结果显示，Erbin的阳性表达主要位于鳞状上皮基底细胞，且定位在细胞的胞质中。肺鳞状细胞癌组织免疫组织化学染色结果显示，Erbin的阳性表达也定位在细胞的胞质中，呈浅黄色至棕黄色颗粒(图1)。肺鳞状细胞癌组织Erbin阳性61例，阳性率为76.25%，癌旁正常肺组织Erbin阳性15例，阳性率为18.75%，两组Erbin阳性率比较差异具有统计学意义(χ2=53.033，P=0.001)。

图1 Erbin在正常肺组织、肺鳞状细胞癌组织中的表达(100×)

2.2 肺鳞状细胞癌组织Erbin表达与临床病理因素的关系

肺鳞状细胞癌组织Erbin的表达与性别、年龄无关(P>0.05)；与患者肿瘤分化类型、肿瘤浸润深度、临床TNM分期、有无淋巴结转移相关(P<0.05；表1)。

表1 肺鳞状细胞癌组织Erbin表达与临床病理因素的关系 单位：例(%)

2.3 不同Erbin表达肺鳞状细胞癌患者生存情况的比较

80例肺鳞状细胞癌患者随访存活1～73个月，中位生存期为36个月，术后1、3、5年生存率分别为76.25%(61/80)、52.50%(42/80)、33.75%(27/80)。Erbin表达阴性患者随访存活1～73个月，中位生存期39个月；Erbin表达阳性患者随访存活1～67个月，中位生存期27个月；Erbin表达阴性患者术后1、3、5年生存率(78.95%、52.63%和36.84%)明显高于Erbin表达阳性患者(50.82%、32.79%和18.03%)(P<0.001；图2)。

图2 不同Erbin表达水平肺鳞状细胞癌患者生存曲线的比较

2.4 肺鳞状细胞癌患者累积生存率单因素分析

经Log-rank检验单因素分析显示：不同年龄段、性别的肺鳞状细胞癌患者，生存率比较差异无显著性(P>0.05)；不同分化类型、临床TNM分期、是否伴有淋巴结转移、肿瘤浸润深度、是否Erbin表达阳性的肺鳞状细胞癌患者生存率比较差异有显著性(P<0.05；表2)。

表2 肺鳞状细胞癌患者累积生存率单因素分析 单位：例(%)

2.5 肺鳞状细胞癌患者预后多因素分析

经多元Cox逐步回归分析，临床分期晚(Ⅲ期)、伴有淋巴结转移、浸润深度>深层肌肉层、高分化类型、Erbin表达阳性为肺鳞状细胞癌患者预后的独立危险因素(P<0.05；表3)。

表3 肺鳞状细胞癌患者预后多元逐步Cox回归分析结果

3 讨 论

肺鳞状细胞癌是肺癌中的常见类型，因疾病进展、淋巴结转移、化疗或放疗抵抗等原因，手术时患者多已处于中晚期，且经手术治疗后，术后5年生存率仍然较低。随着当前医疗技术、靶向治疗等综合治疗的应用，术后生存率有所提高，但肺癌仍然是人类致死的主要疾病之一[6-7]。近年来，分子生物学与基因技术不断发展，恶性肿瘤诊治水平迈上了新台阶[8]。Erbin是一种新的Her2相互作用蛋白，是LAP蛋白家族成员之一[9]。目前有研究报道，LAP家族蛋白Erbin、Seribble、Let413等在上皮细胞极性形成中发挥了重要作用[10]。Erbin在肿瘤疾病的发生、发展中具有两面性，文献[11-12]报道，Erbin在乳腺癌、肝细胞肝癌患者中呈过表达，Erbin可通过调节ErbB2 的稳定性和活性来调控乳腺癌、肝细胞肝癌的发生、发展。而张珊等[13]在宫颈癌生物学分子标志物的研究中发现，Erbin能通过抑制细胞进程而降低癌细胞的增殖。然而，Erbin在肺鳞状细胞癌中扮演何种角色尚存在争论。

有研究显示，Erbin在表皮上部细胞的细胞膜中染色，在皮肤表皮基底层细胞胞质中染色，在表皮鳞状细胞癌组织细胞胞质中呈浅黄色至棕黄色颗粒，表达水平显著升高[14-15]。在本研究中，Erbin在肺鳞状细胞癌组织中呈浅黄色至棕黄色颗粒，阳性表达率明显高于癌旁正常肺组织中阳性表达率，表明Erbin表达上调与某些肿瘤疾病的发生发展相关，且表达量与肿瘤的分期、进展密切相关。本研究80例肺鳞状细胞癌患者中61例Erbin表达阳性，且这些患者肿瘤浸润深度>深层肌肉层，主要呈高分化类型，临床TNM分期更高，更容易出现淋巴结转移。结果说明，Erbin在肺鳞状细胞癌进展中扮演了重要角色，其不仅参与了肿瘤的临床进展，也参与了肿瘤的淋巴结转移。而在直肠癌患者研究中报道，Erbin蛋白表达量降低，并通过抑制ERK和Akt信号通路的活性而起抑癌作用[16-17]。故而，Erbin在不同信号通路中的作用仍然需进一步深入研究。

本研究发现，Erbin表达阳性的肺鳞状细胞癌患者生存时间明显短于Erbin表达阴性患者，结果说明Erbin在肺鳞状细胞癌的进展中扮演了促癌角色，Erbin可作为临床上判断肿瘤预后的参考指标，对Erbin表达阳性的肺鳞状细胞癌患者术后应进行化疗或放疗辅助治疗，以延长预后生存时间。然而经过COX回归模型分析显示，Erbin表达阳性、临床TNM分期高、肿瘤浸润深度>深层肌肉层、伴有淋巴结转移、高分化类型等因素为肺鳞状细胞癌患者预后的独立危险因素。此类肿瘤预后差可能是因为：①在肺鳞状细胞癌患者中Erbin高表达使机体免疫受到抑制[18-19]；②同时Erbin过表达基因异常，癌细胞生长加快，侵犯脉管形成癌栓，从而导致淋巴结转移，临床进展较快[20]。众所周知，基质金属蛋白酶(MMPs)可以通过降解细胞外基质而在肿瘤细胞的侵袭转移中发挥重要作用，在本研究中肺鳞状细胞癌Erbin是否通过增强MMPs的活性而发挥促癌作用，需加大样本量，借助肺鳞状细胞癌细胞系去进一步验证。

综上，本研究发现Erbin的表达在肺鳞状细胞癌组织中明显增加，且Erbin阳性表达与肺鳞状细胞癌患者的不良预后密切相关，这为将来开发针对Erbin的肿瘤靶向药物提供了实验依据，而明确Erbin促进肺鳞状细胞癌细胞侵袭转移的机制是本课题组下一步的研究方向。