水稻OsRPK2基因的克隆及功能初步鉴定

张福臻 刘方惠 陈鑫欣 孙 静 葛荣朝

（河北师范大学生命科学学院，石家庄 050024）

类受体蛋白激酶（Receptor-1ike protein kinas⁃es，RLKs）是在植物中发现的一类激酶，它与动物中的受体蛋白激酶结构相似［1～2］，能够感知细胞传导的信号，然后激活下游信号通路，起到信息传递的功能。自Walker 和Zhang 于1990 年首次从玉米中克隆获得编码类受体蛋白激酶的ZmPK1 基因至今［3］，越来越多的RLKs 被发现，它们结构相似、功能各异。类受体蛋白激酶结构一般包括胞外结构域，跨膜结构域和胞内激酶域三部分。胞外结构域识别信号分子，胞内激酶域被激活后可催化下游分子从而完成信号的传导。胞内激酶域主要有丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶和组氨酸激酶等，胞外受体结构域却有很大的差异，因其结构的不同RLKs 又分为很多亚家族：富含亮氨酸重复序列（Leucine-rich repeat，LRR）型、类表皮生长因子（Epidermal growth factor like）型、类凝集素（Lectinlike receptor kinases，LecRLK）型、类肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）型、S-结构域型（S-domain）和富含脯氨酸的类伸展素受体蛋白激酶（PERKs）等［4～6］。此外，缺少胞外受体结构域的类受体蛋白激酶称为类受体细胞质激酶（Receptor-like cyto⁃plasmic kinases，RLCKs）［7～8］，缺乏胞内激酶域的称为类受体蛋白（Receptor-like proteins，RLPs）［9］。

LRR-RLKs 在植物基因组中是RLKs 的亚家族，其中拟南芥中已经鉴别出200 多个成员，水稻中鉴别出300多个成员［10～12］。LRR-RLKs结构的胞外LRR 序列是由亮氨酸和疏水性残基组成的一个含24 个碱基的保守区域，它是具有β-折叠和α-螺旋构成的“环”状结构。每个LRR-RLKs 结构都有一个或多个不等的LRR，并且胞内的激酶结构也有所差异，这就决定了其功能的多样性［4，13］。

分布广泛的LRR-RLKs 在植物细胞内发挥着重要的生物学功能，可以通过多种信号途径来参与植物的生长发育、抵御非生物胁迫等一系列生命活动［14～24］。水稻抗白叶枯病基因Xa21、番茄抗病基因Cf9 和Cf2 均属于LRR-RLKs，Xa21 蛋白有23 个LRR 单元，Cf9 蛋白有28 个LRR 单元，Cf2 蛋白有多达38 个LRR 单元［25～26］。Park 等发现LRRRLKs 基因OsGIRL1 对盐胁迫和热激反应敏感，在伽玛射线和渗透压胁迫处理时其表达量明显上升，且响应各种激素SA、ABA 和JA 的处理［27］。尽管参与的分子机制仍是未知，但许多被研究的LRR-RLKs 基因在植物中响应非生物胁迫的效果非常明显［28］。

AtRPK1 是拟南芥中受干旱、高盐及低温诱导的富亮氨酸类受体蛋白激酶，在拟南芥对ABA 的早期识别中发挥重要作用。在发芽、生长和气孔关闭期间，AtRPK1 基因的抑制表达将降低植物对脱 落 酸 识 别 的 敏 感 性［29～30］。水 稻 基 因OsRPK1（Os07g0602700）与拟南芥AtRPK1 基因高度同源，AtRPK1、OsRPK1基因过表达拟南芥与对照相比表现出对NaCl、ABA 的耐受性明显降低。AtRPK1-RNAi 拟南芥比对照对NaCl、ABA 的耐受性明显提高［31］。

OsRPK2（Os03g0756200）基因与OsRPK1 的跨膜域和激酶结构域高度同源，编码蛋白质具有相似的结构。OsRPK1 编码1 084 个氨基酸在胞外有较复杂的受体结构域，有15 个明显的LRR 结构。而OsRPK2 基因编码的蛋白质有1 049 个氨基酸，具有12 个LRR 结构。为研究OsRPK2 基因对植物抗逆功能的影响，本文主要对OsRPK2基因过表达拟南芥纯合体在不同逆境条件如盐、干旱和ABA胁迫下的萌发率、幼苗根长、生理指标进行系统检测，对其下游基因进行筛选，以期揭示该基因的抗逆相关功能及其内在机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试水稻种子为日本晴（Oryza sativa L. cv.Nipponbare），拟南芥为哥伦比亚野生型，真核表达载体pCAMBIA1300、大肠杆菌E.coli DH5α、根癌农杆菌GV3101均由本实验室保存。

1.2 OsRPK2的扩增与载体构建

根据对其编码序列进行分析，发现OsRPK2（Os03g0756200）基因并无内含子序列。因此，采用CTAB 法提取水稻基因组DNA，用基因特异引物FP：GTCTAGACGTCGCCTCTCCACCTAC（酶切位点XbaⅠ）和RP：CGGTACCGCAGATATGGAAAGTT⁃GGCTCATTG（酶切位点KpnⅠ）进行PCR 扩增，PCR 体 系20 µL，含2×Prime STAR GC Buffer 10 µL、2.5mmol·L-1dNTPs 2 µL、200 ng·µL-1DNA模板2 µL、10 µmol·L-1引物各1 µL、2.5 U·µL-1PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.2 µL 和ddH2O 3.8 µL。将扩增产物回收、连接到T 载体（pEasy-Blunt Simple Cloning Kit，TransGen Biotech），转入大肠杆菌，提取质粒，用XbaⅠ/KpnⅠ双酶切鉴定，送上海生工生物工程有限公司测序。

提取p1300 和测序正确的pMD18-T-OsRPK2质粒，分别用XbaⅠ/KpnⅠ双酶切，将目的条带电泳、切胶回收、连接，得到p1300：35S：OsRPK2，连接产物转入大肠杆菌，然后提取质粒，XbaⅠ/KpnⅠ双酶切鉴定阳性克隆。将鉴定正确的重组载体p1300：35S：OsRPK2转入根癌农杆菌GV3101。

1.3 拟南芥的转化及筛选

培养含有重组载体p1300：35S：OsRPK2 的农杆菌GV3101，利用浸花法转化拟南芥，收获种子后利用含25 µg·mL-1潮霉素的MS 培养基逐代筛选，直至获得OsRPK2过表达拟南芥纯合体植株。

1.4 转基因拟南芥的抗逆性检测

取3 个35S：OsRPK2 转基因拟南芥纯合体株系和野生型拟南芥种子进行萌发率检测。种子经4℃春化3 d 后消毒，用竹签轻轻点播于含有10%PEG6000、2 µmol·L-1ABA 和120 mmol·L-1Na⁃Cl的MS培养基，以空白MS培养基作对照组，光照培养箱中培养3～4 d，统计萌发率。检测不同胁迫条件下种子萌发情况。

另外，选取35S：OsRPK2 转基因拟南芥纯合体不同株系和野生型拟南芥种子铺在MS 培养基，22℃光照培养箱中垂直培养。培养4 d 至完全萌发，再分别将生长状态一致的幼苗移至含有10%PEG6000、2 µmol·L-1ABA 或150 mmol·L-1Na⁃Cl的MS培养基中，以空白MS培养基作对照组，竖直培养5 d，测量根长生长情况。

为检测转基因拟南芥成株的抗逆性，选取种子铺于MS 培养基上，22℃光照培养箱中正常培养10 d，移栽至蛭石营养土中，苗室光照培养（16 h光照/8 h 黑暗），Hogland 营养液浇灌，培养2 周，莲座叶片全长出即将抽薹时进行整株胁迫处理。2 周不浇水作为干旱处理，浇灌200 mmol·L-1NaCl 作为盐处理，胁迫处理12 d 后观察拟南芥植株生长状况。

1.5 转基因拟南芥的生理检测

1.5.1 叶绿素含量的测定

挑选MS 培养基上生长10 d 且长势一致的拟南芥幼苗移栽入营养土中，正常光照培养约2 周后，分别用清水和200 mmol·L-1NaCl 溶液进行浇灌，每4 d 浇灌1 次。10 d 后取地上部分进行叶绿素含量测定［32］。取其主叶约0.1g，剪成约1cm 片段，置于离心管中，加入5 mL 80%丙酮，避光处理过夜（12 h 以上），用紫外可见分光光度计（PGEN⁃ERAL UV-1800S）测定663 nm 和645 nm 下的光密度值。以80%丙酮为空白对照，重复3次。

叶绿素a浓度（Ca），叶绿素b浓度（Cb）及叶绿素总的含量浓度计算公式如下：

叶绿素a浓度（mg·L-1）：Ca=12.7A663-2.69A645

叶绿素b浓度（mg·L-1）：Cb=22.9A645-4.68A663

叶绿素总的含量（mg·g-1）=（Ca+Cb）×提取液体积×稀释倍数/样品鲜重

1.5.2 丙二醛含量的测定

取转基因拟南芥纯合体与野生型拟南芥幼苗，分别用清水和200 mmol·L-1NaCl 溶液进行浇灌，第5 天时取材。称重拟南芥叶片，加入5 mL 10%三氯乙酸研磨成匀浆，匀浆液以4000 r·min-1离心10 min。吸取上清2 mL（对照取2 mL 蒸馏水），加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，混匀后于沸水浴中反应15 min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600 和450 nm 波长下的吸光值。重复3次，代入以下计算公式：

式中：V为研磨液的体积，W为样品鲜重［33］。

1.5.3 脯氨酸含量的检测

取脯氨酸各浓度梯度标准溶液各2 mL，分别加2 mL 冰乙酸，3 mL 2.5%茚三酮溶液于试管中，沸水浴15 min，冷却后于波长520 nm 测定其OD值，以OD 值为纵坐标，脯氨酸浓度（µg·mL-1）为横坐标绘制标准曲线。测定转基因拟南芥脯氨酸含量，从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下面公式计算样品中脯氨酸含量：

式中：X为从标准曲线中查得的脯氨酸对应浓度（µg·mL-1）［34］。

统计学分析：每个样品进行3 次重复，结果用软件Statistica 6.0 进行t 检验，P<0.05 为差异显著，P<0.01为差异极显著。

1.6 OsRPK2基因的过量表达对下游基因的影响

根据对拟南芥抗逆信号传导通路的遗传分析，选出了位于CDPK、MAPK、SOS 等信号通路下游 的 7 个 基 因 P5CS1（AT2G39800）、ADH1（AT1G77120）、FRY（AT2G37678）、SAD1（AT5G4887 0）、SOS3（AT5G24270）、RD29B（AT5G52300）、ESK（AT1G73140）［35］。剪取3个35S：OsRPK2拟南芥株系和野生型拟南芥的叶片，提取总RNA，反转录获得cDNA，以β-Actin 基因作为内参，调整模板浓度，进行qRT-PCR 检测，每个基因进行3 次重复，qRT-PCR相关基因序列引物见表1。

表1 qRT-PCR引物碱基序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

2 实验结果与分析

2.1 OsRPK2基因的克隆及过表达载体的构建

提取水稻日本晴幼苗叶片总DNA，用高保真Primer Star 酶 进 行PCR 扩 增 获 得3 350 bp 的OsRPK2 基因全长序列（见图1A），将目的片段回收、连接到pMD18-T 载体（见图1B）。对测序正确的pMD18-T-OsRPK2 用XbaⅠ/KpnⅠ酶切获得Os⁃RPK2 片段，连接获得表达载体p1300：35S：Os⁃RPK2（见图1C），将重组载体转入农杆菌备用。

2.2 OsRPK2转基因拟南芥的获得和鉴定

对野生型拟南芥和35S：OsRPK2 拟南芥3 个纯合体株系OX L1、OX L2、OX L3 提取基因组DNA，PCR扩增检测结果表明3个株系均成功转入了外源基因OsRPK2（见图2A）。另外，提取野生型拟南芥和35S：OsRPK2 拟南芥3 个株系的总RNA，反转录获得cDNA，RT-PCR 鉴定结果表明，Os⁃RPK2在3个转基因拟南芥中均成功实现过量表达（见图2B）。

2.3 35S：OsRPK2转基因株系的抗逆性分析

2.3.1 35S：OsRPK2转基因拟南芥种子萌发过程中的抗逆性

对野生型拟南芥和35S：OsRPK2转基因拟南芥3个纯合体株系种子萌发过程中的抗逆性检测结果表明，对照MS培养基上35S：OsRPK2转基因拟南芥3 个株系和野生型拟南芥种子萌发率没有明显差异。在含有10%PEG6000 的MS 培养基上培养3 d后，野生型拟南芥种子萌发率为97%，过表达拟南芥种子萌发率平均为66.4%，其中株系OX L1 的萌发率仅为54%，35S：OsRPK拟南芥株系的种子萌发率明显低于野生型拟南芥。在含有2µmol·L-1ABA的MS培养基上培养5 d后，过表达拟南芥种子萌发率平均为69.8%，明显低于野生型拟南芥。在含有120 mmol·L-1NaCl 的MS 培养基上培养5 d 后，3 个转基因拟南芥株系的种子萌发率平均为74%，也明显低于野生型拟南芥。通过对不同处理条件下的种子萌发率数据统计分析表明，在受到PEG、ABA或NaCl胁迫后，OsRPK2过表达拟南芥株系的种子抗逆性均显著低于野生型拟南芥（见图3～4）。由此可见，OsRPK2 基因的过量表达会造成拟南芥植株表现出对各种非生物胁迫更加敏感的表型。

2.3.2 35S：OsRPK2转基因拟南芥幼苗的抗逆性

对野生型拟南芥和35S：OsRPK2转基因拟南芥3 个株系的幼苗在含有10%PEG6000、2 µmol·L-1ABA 和150 mmol·L-1NaCl 的MS 培养基上竖直培养发现，OsRPK2 过表达和野生型拟南芥在胁迫条件下根的生长均会受到抑制，不同胁迫条件对拟南芥的影响程度也表现不同。通过对各种胁迫对根生长造成的抑制情况进行数据统计分析，Os⁃RPK2 转基因拟南芥根生长长度都要较野生型短，两者根长长度表现出显著差异（见图5～6）。因此，OsRPK2 基因的过量表达会使得拟南芥植株在根的生长发育方面表现出对各种非生物胁迫更加敏感的表型。

2.3.3 35S：OsRPK2过表达拟南芥成株的抗逆性检测

对野生型拟南芥和35S：OsRPK2 过表达拟南芥3个纯合体株系进行不同条件下的盐、旱胁迫处理。在干旱处理12 d 后，过表达拟南芥幼苗的莲座叶边缘出现明显的干黄，叶片萎蔫较严重，而野生型的叶片还较碧绿，而且过表达植株植株较矮，整体长势明显弱于野生型拟南芥。经过200 mmol·L-1NaCl盐胁迫12 d处理后，过表达拟南芥植株的叶片萎蔫程度较野生型更严重，株型较野生型矮小，幼嫩茎尖部位出现萎蔫，开花结果时间也较野生型拟南芥提前（见图7）。由此可见，OsRPK2 基因的过量表达也会造成拟南芥成株对盐、旱胁迫更加敏感。

2.3.4 35S：OsRPK2转基因拟南芥盐胁迫后的生理指标检测

对生长状况一致的野生型拟南芥和3 个35S：OsRPK2 过表达拟南芥株系盐胁迫处理后进行叶绿素、丙二醛以及脯氨酸含量的测定。叶绿素含量测定结果表明，胁迫后OsRPK2过表达拟南芥株系的叶绿素含量明显低于野生型拟南芥（见图8A）。丙二醛含量测定结果表明，在胁迫处理后OsRPK2 过表达拟南芥株系的丙二醛的增加量明显大于野生型拟南芥（见图8B），说明转基因拟南芥植株所受损伤要比野生型拟南芥植株所受损伤更加严重。脯氨酸检测结果表明，盐胁迫后Os⁃RPK2 过表达拟南芥株系的脯氨酸上升量明显低于野生型拟南芥（见图8C）。

2.4 OsRPK2基因的过量表达对下游基因的影响

为研究OsRPK2 基因在敏盐机制中所起的作用，选取了拟南芥中已知与植物耐盐密切相关的7个基因ESK、SAD、RD29B、SOS3、ADH1、P5CS1 和FRY 基因进行qRT-PCR 分析。检测结果表明，Os⁃RPK2 过表达拟南芥植株与野生型拟南芥相比，SAD、SOS3 和FRY 基因的表达都明显受到抑制，ESK、RD29B、ADH1 和P5CS1 基因的表达没有明显变化（见图9）。

3 讨论

植物体类受体蛋白激酶广泛参与了植物体的抗逆信号转导和病原反应等途径，对植物的抗逆性具有重要意义。类受体激酶的表达量上升往往会提高植物体的抗逆性，如拟南芥中类受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因GsRLCK 的过量表达提高了 转 基 因 植 株 对 盐、干 旱 和ABA 的 耐 受 性［36］；PnLRR-RLK27 的过量表达提高了拟南芥对盐、干旱、H2O2和ABA 的耐受性［37］；Soo 等从辣椒中分离获得的CAMRP 基因的表达使拟南芥提高了耐盐性和抗病性［38］。AtRPK1 是Hong 等在1997 年从拟南芥中克隆到的受逆境胁迫诱导的富含亮氨酸重复序列类受体蛋白激酶基因，在脱落酸、脱水、高盐和低温等胁迫环境下转录水平明显增加［39］。OsRPK1 是水稻中与AtRPK1 高度同源的类受体蛋白激酶基因，抗逆性检测表明，AtRPK1、OsRPK1基因的过量表达均造成了拟南芥的耐盐性明显下降，抗旱性显著增强［31］。

OsRPK2 与OsRPK1 基因高度同源，本文利用OsRPK2 基因过表达载体转化拟南芥，筛选获得纯合体种子，对其在逆境胁迫条件下的萌发率进行检测后发现，无论是在盐、脱落酸还是PEG 的胁迫下，转基因拟南芥在种子萌发率方面比野生型拟南芥均有明显降低，OsRPK2 过表达拟南芥表现出了对非生物胁迫更加敏感的表型。在幼苗和成株阶段进行胁迫处理后，OsRPK2 过表达拟南芥在根长生长和成株生长状况方面均表现出比野生型拟南芥更敏感的特征。

为探究OsRPK2 过量表达拟南芥抗逆性改变的生理机制，我们对转基因拟南芥和野生型拟南芥进行盐胁迫处理后，分析检测了叶绿素、丙二醛和脯氨酸的含量，结果发现转基因拟南芥中叶绿素含量下降更为明显，脯氨酸上升量较野生型拟南芥较小，丙二醛含量上升更为明显。叶绿素含量的显著下降、丙二醛积累量的增多说明转基因拟南芥在盐胁迫后所受损伤比野生型拟南芥植株更严重。脯氨酸含量的下降则直接导致转基因拟南芥抵御渗透胁迫能力的降低。

FRY1 和SAD1 位于CDPK 蛋白激酶抗逆信号传导通路［40～41］。SOS3 属于SOS 信号通路，主要调控细胞离子平衡，与SOS2 形成蛋白激酶复合体，激活SOS1（质膜上的Na+/H+反转运蛋白），增加胞内Na+的外排［42］。本研究通过荧光定量PCR 检测，结果发现，OsRPK2 的过量表达使SAD、SOS3 和FRY 基因表达明显受到抑制。因此OsRPK2 的过表达可能造成拟南芥CDPK 和SOS 抗逆信号传导通路的信号传递受抑，造成转基因植株对逆境胁迫的抗逆性下降。

总之，本部分实验确定OsRPK2基因在拟南芥中的过表达会造成植物体对高盐、干旱等非生物胁迫更加敏感，对逆境信号的传导能力降低，至于该基因的过量表达是否全面影响了CDPK 蛋白激酶和SOS 信号通路向下传导抗逆信号，还有待进一步的深入研究加以确认。